HPLC外标法有哪些必知的注意事项？

HPLC法在研究中的应用就是含量测定了，HPLC法应用于含量测定时哪些需要注意的问题？外标法含量计算方式有哪些注意事项是必知的？

除鉴别和有关物质检查外，HPLC法在化学药物中的应用就是含量测定了，另外在制剂的含量均匀度、溶出度、释放度检验项目中，HPLC法也发挥着越来越重要的作用，但其本质与含量测定一样，都是准确定量的测定方法，因此，含量测定也包括含量均匀度、溶出度、释放度等定量检测项目。

1、HPLC法应用于含量测定时需要注意的问题

在建立一个新的HPLC法含量测定方法时，方法建立以及方法学验证方案需要特别考虑下述多种因素对分析结果的影响。

（1）流动相缓冲盐的pH值

流动相缓冲盐的pH值对药物的保留行为有影响，甚至会显著改变某些碱性药物的保留行为。见下图1，当流动相中缓冲溶液的pH为3.0时，出峰顺序为利多卡因、苯甲酰胺、酮洛芬，当流动相中缓冲溶液的pH为10.0时，三种药物的出峰顺序为酮洛芬、苯甲酰胺、利多卡因二即使是梯度洗脱，流动相中缓冲溶液的pH值仍然对药物的保留行为产生影响。

图1 流动相pH值对保留时间的影响

(2)色谱柱

色谱柱的差异也会影响药物的保留行为，即使是柱长、内径、粒径相同的色谱柱，由于填料性质的差异，药物的保留时间、峰型有时会有较大差异。

(3)流动相组成

以多元维生素制剂的含量测定为例，某制剂中含有4种维生素：烟酰胺、维生素B6、维生素B2和维生素B1。如图2所示，当流动相中己烷磺酸钠和庚烷磺酸钠的相对比例由1:1变为4:6时，不仅各组分的保留时间、峰形有变化，甚至峰3、峰4没有实现分离。

图2 流动相组成对药物保留行为的影响

2、含量的计算方式

HPLC的定量方法可以分为内标法和外标法。在仪器发展的初期，由于进样重复性差。为了保证测定结果的准确采用内标法较多。随着自动进样装置的发展，进样的重复性已经足够精密，从90年代开始，大部分的内标法已经被外标法取代。

但是，在药典制剂品种中还有一定数量的HPLC含量测定方法采用内标法。除了尚未修订以外，以前担心的进样重复性已经不是采用内标法的原因，主要是因为药品制剂含量测定中样品回收率或样品制备方法的回收率影响，供试品溶液在萃取、离心处理或其他样品溶液制备过程中不能保证样品的完全提取，以及辅料对低含量药物的吸附作用，采用内标法可避免因供试品前处理及进样体积误差对测定结果的影响。

3、外标法含量计算方式注意事项

外标法含量计算公式：含量=m对*P*A样*V样/（m样*A对*V对）*100%

（1）样品称样量

a、称量方式采用的是加量法还是减量法，都是很有讲究的。正常情况下，肯定要采用加量法，一次称取到位，这样才能得到准确的称样量。

b、称量操作称量时，是否足够小心，不会在转移样品时使样品撒漏，这个是非常重要的。

c、样品如果具有挥发性，直接称样时，必然会挥发一部分造成误差；另外，如果样品不稳定，或在溶液中不稳定，那么实际上来讲，也是影响了样品量。还有，样品要保证均匀，固体不必说，液体样品要保证是均相，称量之前要摇匀。

（2）对照品含量

a、对照品质量对照品是否有合法来源，其含量值是否准确。

b、对照品的保存对照品是否按要求保存，也是至关重要的。因为如果对照品没有按照规定保存，那么其右可能会发生降解，进而影响含量值；另外，如果对照品是保存在冰箱中，称量时，应取出放在干燥器中回至室温再称量，否则其很有可能会吸收空气中的水分，影响含量值。同理，如果对照品引湿性很强的话，长期暴露在空气中，也会使其P发生变化。

（3）样品峰面积

a、如果所用的分析方法可靠性不好，样品峰面积或保留时间容易变化，那么检测结果也是很重现性不好的。

b、如果仪器系统被污染产生残留，而本身峰面积就不大的情况下，这个因素产生的误差就更明显了。

c、如果样品峰形不够好，或者分离度不够好的情况下，积分就很重要。

（4）样品的稀释体积

a、容量瓶、移液管等体积是否准确。一般来说，新买的容量瓶体积是符合要求的，但是也难免会买到个别次品，这就需要进行校验了。

b、容量瓶、移液管规格。这个是很重要的，一般大家都能注意这个问题，做到合理使用。

c、试验习惯问题，容量瓶在使用时，不能使其至于高于40摄氏度的环境下，否则容量瓶会发生变形。

d、定量操作，这个包括容量瓶和移液管的使用，注意事项：

一是移液管吸液时，液面不要高刻度太多，放液时千万不要用洗耳球吹，并且尽量保持每次操作时间都一样，粘度大的溶液尤其需要如此。

二是观察液面时，要使容量瓶和移液管保持垂直，这时很多人喜欢用三根手指捏住，其实这样不容易保持垂直，最好用两根手指，轻轻捏住就好。

三是注意接触容量瓶移液管等的面积越小越好，以免体温加热溶液。

e、如果对照品和样品没有用同一份稀释剂稀释的话，两者就会有差异，受到温度变化的影响也是不一样的。比如，所用的稀释剂为水：甲醇=50：50，对照溶液用的是上次配好的，然后样品用的是新配的，因为水和甲醇混合会放热，其体积也会增大，等到进样时，样品溶液回至室温，体积减小，就会造成检测结果偏高。

f、如果前后室温变化的话，也会造成分析结果的误差。比如，对照溶液进样时，是正常上班时间，实验室开了空调，温度为20℃，而到样品溶液进样时，已经到下班时间了，实验室人员下班时将空调关闭，实验室温度已经降为10℃，这时样品溶液浓度肯定也会增大。

g、由于对照品相对比较贵重，一般实验室都会保存一段时间。如果下次分析时没有回至室温，或此时室温与对照品溶液配制时的温度已经发生了明显的变化，都会造成分析结果的误差。

h、有些人配好样品后，喜欢用手去握着容量瓶，细心观察的就会发现一会之后液面就明显高于刻度。如果操作者没有注意这点，有的样品立即进样，有的排队过了一会再进样，就会造成误差。