科研 | FOOD CHEMISTRY：代谢组和转录组分析绿色和紫色芦笋花青素积累及相关基因（国人佳作）
编译：寒江雪，编辑：十九、江舜尧。
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芦笋(A.officinalis L.)是一种营养价值很高的蔬菜作物。本研究选择三个紫芦笋品种京紫2号，紫色激情和太平洋紫，一个绿色芦笋京绿1号作为研究对象。在紫色和绿色品种中，鉴定出16种花色苷，其中芍药苷、花青素及其糖苷衍生物是主要的花青素。转录组数据显示大部分花青素生物合成基因和5种转录因子在绿色和紫色品种间差异显著。暗处理实验表明芦笋在无光条件下不产生花青素，暗处理下花青素生物合成和调控基因均显著下调，说明芦笋花青素的积累依赖于光。本研究结果为了解芦笋花青素积累和花青素生物合成的分子机制提供了重要的信息。
论文ID
原名：Anthocyanins Accumulation and Molecular Analysis of Correlated Genes by Metabolome and Transcriptome in Green and Purple Asparaguses (Asparagus Officinalis, L.)
译名：代谢组和转录组分析绿色和紫色芦笋花青素积累及相关基因
期刊：FOOD CHEMISTRY
IF：5.399
发表时间：2019.1
通讯作者：李宗芸
通讯作者单位：江苏师范大学生命科学学院
DOI号：10.1016/j.foodchem.2018.07.120
实验设计
本研究选择京紫2号，紫色激情和太平洋紫三个紫色品种和一个绿色品种京绿1号的表皮为研究对象。分别取光处理和暗处理出芽3天的表皮用于qRT-PCT和花青素含量的测定。分别比较正常生长的京绿1号和京紫2号差异分组的差异基因和光处理和暗处理的京紫2号差异分组的差异基因，分析差异基因的功能，并对其候选基因进行表达量的检测。
结果
1 紫芦笋和绿芦笋中花青素的含量
为了阐明芦笋中色素生物合成的机理，选择京绿1号作为对照，三个紫色品种作为研究对象。从外观上看，三个紫色品种的紫色色素更多（图1A）。MRM分析证实紫色组织中提取的色素为花青素（表1）。采用pH差示分光光度法测定了3日龄芦笋茎皮中总花青素的含量。其中紫色激情花青素含量高，太平洋紫最低（图1B），紫色芦笋中的花青素含量远高于其他的紫色蔬菜如紫甘蓝，茎瘤芥等，因此，紫色芦笋是作为花青素补充剂的一个很好的选择。在表皮中也检测到了花青素，说明紫色芦笋带皮一起食用是有益的。京绿1号的花青素积累量较小，因此该品种的穗常呈红色（图1），表明花青素积累的显著差异是品种和遗传多样性的结果。
2 芦笋表皮中花青素的鉴定
为了检测4个芦笋品种的花青素含量，对表皮提取物进行了MRM分析。在3种紫色品种中检测到14种花青素，其中牡丹素、花青素及其糖苷衍生物是主要的花青素（表1）。在京绿1号中检测到11中花青素，绿色品种的牡丹素和花翠素的含量显著高于紫色品种，说明绿芦笋也有花青素积累，这与花青素含量测定结果一致。在京紫2号和京绿1号中检测到锦葵素葡萄苷，但在另外两个紫色品种中没有检测到，表明京紫2号和京绿1号可能具有共同的起源。在3个紫色品种中检测到了相同种类的花青素，但这些花青素含量存在较大差异，表明这些紫色品种在花青素生物合成或调控基因表达上可能存在差异。
3 紫色和绿色品种的转录组分析
为了研究紫芦笋花青素积累的机理，对京紫2号和京绿1号进行转录组测序分析，组装得到91977个unigene，并对unigene进行GO和KEGG功能注释。差异分析得到1429个差异基因，差异基因GO注释到52个功能。在生物学过程中，代谢过程，细胞过程和单器官过程富集最显著。细胞组分分类下，细胞，细胞部分和细胞器功能显著富集。分子功能中，催化活性和结合显著富集。COG数据库注释，有985个基因有注释，注释到25个COG类别，275个基因注释到一般功能预测这一类别。没有基因注释到“细胞外结构”和“核结构”类别。GO和COG注释表明，在芦笋中表达的unigene编码不同的代谢相关蛋白。
为了鉴定富集的代谢途径，对差异基因进行KEGG代谢通路注释，最显著富集的是代谢途径通路，其次是遗传信息处理。细胞过程，环境信息处理和有机体系统等通路富集情况低于前两条通路。本研究侧重与不同颜色芦笋品种花青素代谢的差异，因此类黄酮代谢是检测到的途径之一。在该途径中共检测到12个差异表达基因，表明这些基因可能与不同芦笋品种的颜色有关。这些结果为进一步研究芦笋花青素积累的分子机制提供了有用的信息。
4 四个芦笋品种花青素生物合成基因的差异表达
转录组结果分析得到2802个DEG，其中1467个基因在紫色品种中上调，1335个基因在绿色品种中下调。本研究的重点是绿色品种与紫色品种花青素积累的差异，因此，对与花青素生物合成相关的编码蛋白进行了鉴定。在紫色品种中2个PAL基因，7个4CL基因，1个CHS基因，1个CHI基因，1个F3'H基因，1个DFR基因和1个ANS基因显著上调。另外2个PAL基因，1个4CL基因，1个CHS基因和1个F3'H基因显著下调。
为了进一步验证结果，用qRT-PCR方法检测了四个材料表皮中这些花青素生物合成酶的转录水平。结果表明，CHS(Gene 28623)、CHI(Gene 195770)、F3'H(Gene 25149)、DFR(Gene 14115)和ANS(Gene 19970)等花青素生物合成基因在3个紫芦笋品种中均显著上调。与绿色对照相比，紫色品种的PAL(Gene 30666)、C4H(Gene 19952)、4CL(Gene 10768)、F3'H (Gene 25718)和3GT(Gene 2875)的表达无显著差异（图2）。而且在三个紫色品种中上调程度也不同，紫色激情中大多数花青素生物合成基因的表达量比其他两个紫色品种更高。这些结果与转录组分析结果一致，进一步证实了RNA-seq分析的可靠性。
5 四个芦笋品种花青素调控基因的差异表达
除了结构基因外，转录因子在调节类黄酮生物合成的整体活性方面也起着重要作用。bHLH、R2R3-MYB转录因子和WD40蛋白是花青素生物合成基因激活的三个主要调控因子。转录组结果中，7个编码bHLH蛋白的DEG，有4个上调基因，3个下调基因。预测了29个差异表达的unigene编码MYB转录因子，其中有14个上调，15个下调。在京紫2号和京绿1号中检测到19个WD40重复蛋白，但只有3个蛋白差异表达。
除了MBW复合体外，据报道还有其他转录因子调节花青素的生物合成，如bZIP，HY5，HYH，MADS-box等转录因子。本研究结果中发现2个bZIP基因存在差异表达，1个上调1个下调。检测到3个差异表达的MADS-box基因，其中一个基因被强烈诱导表达，而另外两个基因的表达显著降低。
为了进一步证实转录分析的结果，检测这些调控基因、2个MYB基因、1个WD40基因、1个bZIP基因和1个MADS-box基因在4个材料中的表达。结果表明，与绿色品种相比，gene 5468、gene 23512、gene 8628和gene 31345等4个转录因子在3个紫色品种中的表达均上调（图3）。gene 2565的表达无明显差异，gene 10703在三个紫色品种中的表达均显著下调。与花青素生物合成基因表达测定结果相似，在三个品种中均检测到不同程度的诱导或下调这些调控基因的表达。这些结果与不同的花青素水平、生物合成基因表达测定和RNA-seq数据吻合，进一步证实了花青素积累的显著差异是遗传多样性的结果。
6 光照对芦笋花青素积累的明显影响
为了研究光照对芦笋生长发育和色素产生的影响，对两个材料在光照和黑暗条件下生长的茎尖进行了测定。在光照和黑暗条件下测定出芽后3天的总色素含量。如图4A所示，暗处理的紫色品种中没有产生花青素，暴露在光下时，三个紫色品种立即产生紫色色素。花青素含量分析结果表明光照条件下培养的紫色素含量明显高于黑暗条件下培养（图4B）。这些结果表明，芦笋花青素的产生是依赖光的，这解释了只在芦笋表皮中积累花色苷的原因。在大多数积累花青素的物种中也观察到了这种现象，紫芦笋花青素的生物合成和调控机制可能与这些物种相似，育种者可以通过这些物种的育种经验来培育富含花青素的品种。
7 光照和黑暗条件下紫色品种花青素的生物合成与调控基因表达
为了解光照对芦笋花青素形成的分子效应，以暗培养的京紫2号芦笋表皮为材料进行了RNA-seq分析。在黑暗和光照条件下共观察到3637个差异表达的unigene。在这些基因中包括3个PAL，1个C4H，14个4CL，3个CHI，4个F3H，2个F3’H，1个DFR和3个3GT基因。
转录因子分析发现京紫2号在黑暗和光照条件下有19个编码bHLH的差异表达基因，其中有6个上调，13个基因下调。56个MYB基因差异表达，其中31个上调，25个下调。光照条件下生长的表皮中，编码WD40重复蛋白的一个Unigene的表达量比在黑暗中生长的表达量低。9个bZIP基因表达存在差异，1个MADS-box基因在光照条件下的表皮中表达下调。在黑暗处理做对照组中检测到的DEG比京绿1号多。光、暗条件下京紫2号的基因表达差异远大于京紫2号与京绿1号的差异，表明在紫芦笋中观察到的花青素调控基因的表达是受光调控的。
为了进一步验证这些结果并检测另外两个紫色品种的基因表达情况，用qRT-PCR技术分别分析了三个紫色品种和绿色品种在光和暗条件下花青素生物合成和调控基因的表达模式。除类APL外，花青素生物合成基因PAL，C4H，4CL，CHS，CHI，F3H，F3’H和DFR结果均与转录组结果一致（图5），花青素调控基因结果也与转录组一致（图6），光处理的紫芦笋表皮中的积累量明显高于暗处理的紫芦笋。在绿色品种中没有观察到这一趋势，光处理和暗处理的表皮之间的表达差异较小或者结果相反，进一步表明这些基因可能与花青素调节有关。
在花青素生物合成基因中，京紫2号在光照条件下的表达明显高于暗条件下，而在其他两个紫色品种中的表达趋势则相反（图5），表明京紫2号与其他两个紫色品种可能具有不同的起源。在调控基因中，暗处理芦笋中积累的类APL转录本数量比光处理芦笋中积累的多得多（图6），进一步证实了类APL可能对花青素的调节起到抑制作用。综上所述，花青素的生物合成和调控基因可能是光依赖性的。
结论
本研究综合运用MRM、转录组和qRT-PCR等方法，对芦笋花青素积累的机制进行了分析。紫芦笋表皮中检测到15种花青素，其中牡丹素，花青素及其糖苷衍生物是主要的花青素。利用RNA-seq和qRT-PCR对一系列花青素生物合成和调控基因进行了分析。结果表明，芦笋花青素的积累以及大部分花青素生物合成和调控基因的表达均依赖于光。这些结果加深了对芦笋花青素积累和生物合成分子机制的理解，并为选育富含花青素品种提供了一系列候选基因。
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