组织学技术 Gomori染色法
醛品红染色法(弹性纤维)
⑴组织用10%甲醛液、甲醛酒精液或Bouin液,避免用含铬盐的固定液。常规脱水,石蜡包埋、切片。
⑵切片脱蜡,经酒精下行至蒸馏水。
⑶0.5%高锰酸钾(Potassium permanganate)水溶液1~2分钟,流水洗。
⑷1%草酸(Oxalic acid)水溶液1分钟,水洗1分钟。
⑸50%酒精1~2分钟。
⑹醛品红液染色5~15分钟(冬天37℃温箱染10分钟),蒸馏水速洗。
醛品红液:碱性品红(Basic fuchsin)0.5克溶于蒸馏水100毫升,加热煮沸过滤。取滤液加浓盐酸(hydrochloric acid)1毫升和三聚乙醛(Paraldehyde)1毫升,将溶液倒入锥形瓶加塞,放室温3~4天,经常摇动,再过滤,将滤纸和沉淀物置温箱烘干。将烘干的沉淀染料粉0.5克加70%酒精100毫升。
醛品红的配制另一法:碱性品红0.5克溶于70%酒精100毫升,加浓盐酸及三聚乙醛各1毫升,静置24小时,溶液呈深紫色,保存于冰箱备用。
⑺95%酒精分色至背景无色。
⑻蒸馏水洗30~60秒。
⑼1%亮绿(Brilliant green)水溶液染2~5分钟,蒸馏水速洗。
⑽95%酒精分色至纤维颜色分明,无水酒精脱水。
⑾二甲苯透明,中性树胶封片。
结果:弹性纤维紫色,胶原纤维绿色,核紫红色。
本法能很好显示血管壁、肺泡壁和皮肤等组织中的弹性纤维。醛品红染色不能过染,否则不易分色。
Gomori染色法(网状纤维)
方法:
⑴新鲜组织固定于10%甲醛液、Zenker液或Susa液,常规脱水、石蜡包埋切片。可作冰冻切片。
⑵石蜡切片经二甲苯脱蜡,各级酒精 下行至蒸馏水。
⑶0.5%或1%高锰酸钾水溶液2分钟,流水洗。
⑷3%亚硫酸钾(Potassium sulfite)或草酸2分钟,流水洗。
⑸2%铁明矾(Ammonium iron (III) sulfate dodecahydrate)水溶液3分钟,蒸馏水洗2~3次约2分钟。
⑹氨银液1~5分钟(冬天37℃温箱),蒸馏水速洗两次。
氨银液:10%硝酸银(Silver nitrate)水溶液20毫升加10%氢氧化钾(Potassium hydroxide)水溶液4毫升,产生 灰黑色沉淀。充分手荡至沉淀沉底,倾去上清液。沉淀用蒸馏水洗3~4次,边摇边加浓氨水(Ammonia),直到沉淀全部溶解。再滴加10%硝酸银数滴使溶液稍混浊,又加氨水使溶液清亮。最后加蒸馏水稀释至100毫升。保存于棕色瓶。
⑺5%甲醛水溶液还原5分钟,流水洗。
⑻0.2%氯化金(Gold monochloride)水溶液调色3分钟 ,蒸馏水洗。
⑼3%亚硫酸钾处理1分钟,蒸馏水洗。
⑽2%硫代硫酸钠(Sodium hyposulfite)水溶液1分钟(除去银离子),蒸馏水洗。
⑾95%酒精和无水酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。
结果:网状纤维黑色;细胞核灰黑色;胶原纤维深黄色。
Gomori醛品红染色法(胰腺胰岛细胞)
方法:
⑴取小块胰腺组织固定于Bouin液。
⑵常规脱水、包埋、切片。
⑶切片常规脱蜡至水。
⑷Lugol碘液氧化10分钟,切片呈褐色。
⑸2.5~5%硫代硫酸钠水溶液漂白至切片呈白色,流水冲洗3分钟。
⑹入70%酒精。
⑺醛品红液染色10~30分钟。
醛品红液:碱性品红(Basic fuchsin)1克溶于70%酒精 200亳升,加盐酸和三聚乙醛(Paraldehyde)2毫升。充分摇荡,置室温直到溶液呈紫红色。约需24~48小时。保存于冰箱内。可用2~3个月。
⑻明矾苏木精染核,盐酸酒精分色,水洗。
⑼亮绿-橘黄液染色10多分钟或稍长。
亮绿-橘黄液:亮绿0.2克,橘黄G(Orange G) 1克,磷钨酸(Phosphotungstic acid)0.5克,蒸馏水100毫升,冰醋酸( Glacial acetic acid)1毫升
⑽0.2%冰醋酸水溶液速洗。
⑾95%酒精分色至甲细胞黄色。
⑿无水酒精快速脱水,透明,封片。
结果:A细胞黄色;B细胞紫红色;D细胞绿色;核蓝黑色;腺泡细胞酶原颗粒橘黄色。
Gomori铬明矾-苏木精-焰红染色法(胰腺胰岛细胞)
方法:
⑴小块胰组织固定于Bouin液。
⑵常规脱水、包埋、切片。
⑶切片脱蜡经酒精下行至水。
⑷Bouin液再固定12~24小时。
⑸流水冲洗5分钟。
⑹重铬酸钾硫酸液处理5分钟。
重铬酸钾硫酸液:重铬酸钾0.15克,蒸馏水100毫升,硫酸(Sulfuric acid)0.15毫升
⑺5%偏重亚硫酸钠水溶液5分钟。
⑻流水冲洗5分钟 。
⑼苏木精液染色10~~15分钟。
苏木精液:苏木精0.5克溶于蒸馏水50毫升,加3%铬明矾水溶液50毫升,充分混合,再加5%重铬酸钾水溶液20毫升、0.5N硫酸(约2.5毫升加水至100毫升)2毫升,48小时后过滤。
⑽1%盐酸水溶液分色约1分钟至乙细胞镜检呈深蓝色。
⑾流水冲洗约5分钟至切片呈蓝色。
⑿0.5%焰红水溶液染色5分钟,蒸馏水速洗。
焰红液:焰红(Phloxine)0.5克,蒸馏水100毫升
⒀5%磷钨酸水溶液1分钟,流水冲洗至切片呈红色(约5分钟)。
⒁95%酒精 分色。如切片太红或镜检A细胞(甲细胞)染色不够清晰,可在80%酒精内处理15~20秒。
⒂常规脱水、透明、封片。
结果:A细胞红色;B细胞蓝色;D细胞淡红色至红色 (不易与A细胞区分)。
Gomori-Takamatsu钙钴法(碱性磷酸酶)
⑴组织用80%酒精固定24小时(4℃),常规脱水、透明石蜡切片;或冷丙酮(Acetone)24小时(-20℃),室温换丙酮两次2小时,苯透明,换两次45分钟,石蜡包埋。丙酮固定的效果最好。
⑵石蜡切片脱蜡下行入水。
⑶在底物内37℃孵育1~3小时(针对不同组织隔一定时间取出一张试片),蒸馏水速洗一次。
底物(孵育液):3%β甘油磷酸钠(Sodium glycerophosphate)水溶液10毫升,2%巴比妥钠(Barbitone sodium)水溶液10毫升,蒸馏水5毫升,2%氯化钙(Calcium chloride)水溶液20毫升,5%硫酸镁(Magnesium sulfate)水溶液1毫升,pH9.0~9.4
⑷2%硝酸钴(cobalt(ii)nitrate)水溶液2分钟,水速洗1次。
⑸1%硫化铵(黄)(Ammonium sulfide yellowish)水溶液1分钟,水洗2~3分钟。
⑹中性红(Neutral red)或沙黄(番红 Safranin O)染色1分钟,流水洗。
⑺常规脱水,透明,封片。
结果:碱性磷酸酶所在处为褐至黑色;核红色。
冰冻切片孵育液为:2%巴比妥钠4毫升,3%B-甘油磷酸钠4毫升,2%氯化钙8毫升,5%硫酸镁0.4毫升,蒸馏水2毫升。时间1~3分钟(不超过5分钟),37℃,不必脱水,甘油明胶封片。
对照片:孵育液中不加甘油磷酸钠,改为蒸馏水。
Gomori钙钴法(碱性磷酸酶)
⑴取2~3毫米厚的组织固定于冷丙酮24小时(换2次),或甲醛固定冰冻切片。
⑵丙酮固定的组织直接浸蜡(56~60℃),减压包埋20~30分钟或不减压延长浸蜡时间,朝暮 块保存于冰箱中,不超过24小时。
⑶切片10微米,粘片温度40℃以下,放干燥器内于冰箱中干燥12~24小时或37℃温箱2小时,使其干燥。
⑷脱蜡,经酒精至水。
⑸入作用液(pH9.2~9.8)(先在37℃温箱加温30分钟)90~120分钟。
作用液:2%甘油磷酸钠水溶液10毫升,2%巴比妥钠水溶液10毫升,2%硝酸钙水溶液5毫升,蒸馏水25毫升
⑹入1%硝酸钙(Calcium nitrate)水溶液2分钟。
⑺入1%硝酸钴水溶液2分钟。
⑻蒸馏水洗2次1分钟。
⑼1%硫化铵水溶液1分钟。
⑽自来水洗5~10分钟。
⑾甘油明胶封片或经酒精脱水、透明、树胶封片。
结果:碱性磷酸酶呈浅灰色、灰黄色或灰黑色。颜色深表示酶多。
用甲醛固定冰冻切片的组织,切片直接入作用液。
对照片:浸于不加甘油磷酸钠的作用液,或作用液前于80℃烤箱加温60分钟,则酶无反应。
Gomori铅法(酸性磷酸酶)
⑴取2~3毫米厚的组织固定于冷丙酮24小时(换2次),或甲醛固定冰冻切片。
⑵丙酮固定的组织直接浸蜡(56~60℃),减压包埋20~30分钟或不减压延长浸蜡时间,朝暮 块保存于冰箱中,不超过24小时。
⑶切片10微米,粘片温度40℃以下,放干燥器内于冰箱中干燥12~24小时或37℃温箱2小时,使其干燥。
⑷脱蜡,经酒精至水。
⑸入作用液(pH5)1~24小时,蒸馏水洗。
作用液:1.36%醋酸钠(Sodium acetate)水溶液4毫升,6%醋酸(Acetic acid)2毫升,5%醋酸铅(Lead acetate)水溶液2毫升,2%甘油磷酸钠水溶液6毫升,蒸馏水12毫升。混合后静置数小时,保存于冰箱,用前过滤,以蒸馏水稀释2~8倍。
⑹2%醋酸水溶液速洗,蒸馏水洗。
⑺1%硫化铵水溶液2分钟。
⑻自来水洗5分钟。
⑼脱水、透明、树胶封片,或水洗后甘油明胶封片。
结果:酸性磷酸酶呈黄棕色至棕黑色。
对照片:作用液内不加甘油磷酸钠。