Nature子刊：新报道的sEV分泌抑制剂的效果不能重复，原作者回应

2019年，Baek研究团队在Nature Communications 杂志发表文章（Nature子刊老药新用：抗菌药物通过抑制肿瘤外泌体分泌发挥抗癌作用），报道了抗菌药物通过抑制肿瘤外泌体分泌发挥抗癌作用。该研究通过筛选FDA批准的药物库，确定了口服抗菌药物磺胺异恶唑（SFX）作为乳腺癌细胞生物发生和分泌sEV的特异性抑制剂，从而有效抑制乳腺癌生长和转移无明显毒性。

近日，澳大利亚拉筹伯大学的Suresh Mathivanan团队在体内研究中寻找可阻止EV生物发生和分泌的化合物时，打算使用SFX，因此将体外表征作为第一步。然而，Mathivanan团队发现，用SFX处理两种癌细胞并不能减少EV的数量。

该研究发现，用SFX处理4T1乳腺癌细胞并没有减少EV的数量。作者也承认，他们的EV分离方法与原始报道的方法不同（图1），因此可能导致不同的结果。为了排除EV分离或细胞类型依赖性方法差异的可能性，三名研究人员严格遵循原作者采用的方法（图1 的protocol 1和2）从两种不同细胞类型（4T1、MDA-MB231）中分离EV。Protocol 1（图1b）与Im等报道的Protocol完全相同，而Protocol 2是作者在尝试重复他们的实验时与他们联系时提供的。对于Protocol 2（图1），通过对Protocol1的细微修改，分离出EV（在2500×g的条件下进行15分钟的离心分离，并在4℃将sEV孵育1h）。与Protocol 1相比，Protocol2中的修改在图1b中用*表示。

两组细胞培养、药物处理和sEV分离的示意图

所有这些测定均针对每个生物重复进行三个技术重复（将相同批次的细胞接种在三个不同的培养皿中）进行。与之前的观察一致，用不同浓度的SFX（50、100和200μM）处理癌细胞不会阻碍EV的释放，而低浓度（5μM）的阳性对照神经酰胺抑制剂GW4869则抑制了EV的分泌。EV分离后，对蛋白质含量、颗粒数量进行了定量，并对富含EV的蛋白质（TSG101、Alix）进行了蛋白质印迹分析，所有这些都标准化为相等的细胞数（图2和补充图1）。与原作者声称的SFX处理结果（导致EV颗粒数量下降了3倍）相反，该研究观察到SFX（200μm）处理后颗粒数量显著增加。

有或没有SFX和GW4869处理的细胞释放的EV的定量

即使该研究作者遵循原作者报告的确切方案，该研究作者也承认研究之间存在一些不同的变量。例如，两项研究中使用的细胞系可能来自不同的传代，并且在连续培养后可能遗传分化。同样，两项研究中使用的FBS、条件培养基、NTA设备和软件也有所不同。两项研究之间的另一个差异是，MDA-MB231细胞分泌的EV蛋白量相差10倍（Baek组报告每百万细胞7µg，Mathivanan组报告每百万细胞0.7µg）。但是，对于药物孵育研究，无论这些变量如何，都应观察到抑制或增加EV释放的总体趋势。例如，据报道，神经酰胺抑制剂GW4869降低了几组EV的释放，而与分离方案和细胞培养变量无关。

总体而言，该研究报告SFX并不能减少EV的释放（三名独立研究人员），并强调在使用SFX作为阻止EV释放的药物时要谨慎。然而，尽管该结果表明观察到的表型可能不是癌细胞衍生的EV介导的，但该研究作者承认该发现并未挑战SFX介导的减轻原发性肿瘤负担和转移的主要结论。SFX如何减少原发性肿瘤负担并抑制转移，尚需进一步研究。

对此，原作者Baek团队进行了回应。

原作者最初的报道显示了SFX抑制了MDA-MB231人乳腺细胞系中sEV的分泌。此外，两名独立研究人员再次通过盲法测试确认了原始结果。原作者确信，SFX在他们的实验中确实抑制了小的细胞外小泡（sEV）的分泌。

用来分离sEV的方法与已出版的手稿相同；将从MDA-MB231细胞获得的上清液以300×g / 3 min，2500×g / 20 min和10,000×g / 30 min连续离心。此外，将细胞用含10％胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良的Eagle's培养基（DMEM）/高葡萄糖（HyClone，SH30243.01）接种，但将其在DMEM /高葡萄糖中孵育，用SFX处理细胞时，不使用FBS。

原作者认为，应从本质上考虑这两点。首先是SFX的细胞毒性作用，这可能是由于不同公司的SFX意外杂质造成的。原作者在所有实验中均使用了没有细胞毒性的SFX浓度。如果药物引起细胞毒性，分泌的sEV数量可能会增加。其次，在原作者的实验室研究中，EV去除的FBS中仍然残留大量颗粒。因此，可能难以观察到使用缺乏EV的FBS对sEV分泌的抑制作用。

有或没有SFX 100 µM处理的MDA-MB-231细胞的sEV分泌

所有实验均采用盲法测试

参考文献：

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FonsekaP, Chitti SV, Sanwlani R, Mathivanan S. Sulfisoxazole does not inhibit the secretion of small extracellular vesicles. Nat Commun.2021 Feb 12;12(1):977. doi: 10.1038/s41467-021-21074-x. PMID: 33579909.

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