你也能学会的8+分预后分型新思路
Theranostics (IF=8.579) 上的一篇文章：“Aristolochic acid mutational signature defines the low-risk subtype in upper tract urothelial carcinoma”。作者通过全基因组测序、层次聚类分析、Kaplan-Meier生存分析等方法，分析AA突变特征与AA中草药暴露及预后的相关性。接着，作者利用HLAscan和NetMHC 4.0软件计算不同亚型的肿瘤新生抗原数，并结合免疫浸润、免疫组化结果进行分析。最后，作者利用低深度全基因组测序，发现在cfDNA中可检测到AA突变特征，提示AA突变特征具有临床应用价值。
Aristolochic acid mutational signature defines the low-risk subtype in upper tract urothelial carcinoma
马兜铃酸突变特征可用于识别上尿路尿路上皮癌低风险亚型
一、研究背景
尿路上皮癌（urothelial carcinoma, UC）是最常见的泌尿系统恶性肿瘤之一，其中大约90%-95%为膀胱尿路上皮癌，而上尿路尿路上皮癌（upper tract urothelial carcinoma, UTUC）仅占5%-10%。然而，在东亚地区（如中国）UTUC的占比却超过30%。据相关研究报道，这可能与服用含有马兜铃酸（aristolochic acid, AA）的中草药有关。因此，作者旨在通过此研究揭示中国UTUC的临床分子特征并提出潜在的诊疗思路。
二、分析流程
三、结果解读
1. 中国人群上尿路尿路上皮癌（UTUC）的基因特征
作者对90例UTUC样本（包括43例新鲜冷冻UTUC样本与47例石蜡包埋样本）进行全基因组测序，其中单核苷酸变异（SNVs）和插入缺失的位点数的中位数分别为19639和2197。结合临床信息，作者发现突变数的增加与AA中草药暴露有关。其中，AA中草药暴露指根据患者自述，曾服用含AA或含AA衍生物的中草药，且服用时间超过1年。
作者使用MutSigCV软件对驱动基因进行了检验（Q＜0.05），筛选出了TP53和FPG2C（图1）。然而，许多COSMIC CGC（Cancer Gene Census）中罗列的驱动基因发生了非沉默突变（如KMT2[A,C,D]、ARID1A），这些驱动基因往往在西方UTUC患者中非常常见。此外，作者也发现了TERT启动子突变和FGFR3突变，尽管突变频率低于前人研究。由此可见，作者的UTUC研究队列与西方UTUC队列存在一定相似性，也存在许多突变基因的差异。
图1.UTUC突变全景图
2. AA突变特征提示预后良好的UTUC亚型
作者使用MutationalPatterns包进行突变特征分析，将COSMIC中23个突变特征根据病因相同与否进行了合并，由此得到了10个突变特征。其中，作者将突变特征22命名为AA。根据SNVs数进行了层次聚类分析，分为两个亚型：AA Sig和NO-AA Sig（图2A）。
如图2B所示，AA Sig亚型中，突变特征22（AA）数高于NO-AA Sig亚型，差异具有统计学意义（p＜0.001）。作者发现AA Sig亚型女性患者比例高，且与服用含AA的中草药、较差的肾功能、肿瘤多病灶、T分期较低等因素有关（图2C）。Kaplan-Meier生存分析显示，无论是无转移生存期还是肿瘤特异性生存期，AA Sig亚型生存率都高于NO-AA Sig亚型（图2D, 图2E）。在肌层浸润性UTUC患者中，AA Sig亚型同样具有更高的无转移生存率和肿瘤特异性生存率（图2F, 图2G）。可见，具有AA突变特征的AA Sig亚型预后较好。
图2.AA突变特征与预后良好的UTUC亚型相关
3. 区域癌化与AA Sig亚型的多病灶有关
作者发现AA Sig亚型中，多病灶发生率与膀胱复发率更高（表1），而区域癌化与这两者密切相关。作者对3位AA Sig亚型患者（包括一位多病灶UTUC患者）进行了测序，在多病灶UTUC患者的尿路上皮和肿瘤组织中发现了AA突变特征（图3A, 图3B），这提示AA暴露可能与区域癌化有关。然而，多病灶UTUC患者的尿路上皮中并未发现拷贝数变异（图3C）。系统发育关系分析显示，该位多病灶UTUC患者2015年的肾盂肿瘤与膀胱肿瘤具有相关性（图3D），提示区域癌化和管腔种植可能共同导致了AA Sig亚型患者多病灶与膀胱复发的发生。此外，在其他两位AA Sig亚型患者的尿路上皮与肿瘤组织中同样发现了AA突变特征（图3E），其中一位AA Sig亚型患者的尿路上皮中发现了拷贝数变异（图3F）。
表1.AA突变特征与患者临床特点的关系
图3.区域癌化与与恶性转化有关
4. AA Sig亚型患者可能是肿瘤免疫治疗的潜在人群
相关文献指出AA Sig亚型具有较高肿瘤突变负荷，因此可能适合接受免疫检查点阻断疗法。作者使用HLAscan进行HLA分型，利用NetMHC 4.0预测肽段与MHC I型分子的亲和力，筛选标准为rank值＜0.5。结果显示，AA Sig亚型具有更高的肿瘤新生抗原数（图4A）。如图4B所示，CD3+淋巴细胞数目与基质中肿瘤浸润性单核细胞数目（tumor-infiltrating mononuclear cells, TIMCs）正相关，且AA Sig亚型具有更多的基质TIMCs和CD3+淋巴细胞（图4C, 图4D），提示肿瘤免疫疗法可能对AA Sig亚型患者有效。最后，作者展示了具有代表性的AA Sig亚型和NO-AA Sig亚型的免疫组化图（图4E, 图4F）。
图4.AA Sig亚型具有更高的肿瘤新生抗原负荷与免疫细胞浸润
5. 通过尿液游离DNA（cfDNA）检测AA突变特征并提示AA暴露与AA Sig亚型
作者选择了人肾小管上皮细胞系HK-2和人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1，分别加入50%半数抑制浓度（IC50）的马兜铃酸钠后进行培养。结果显示，HK-2对AA处理更敏感（图5A），且经马兜铃酸钠处理后的HK-2中可检测到AA突变特征（图5B）和拷贝数变异，而SV-HUC-1中则都不能检测到。利用低深度全基因组测序数据，作者检测了26位UTUC患者的尿液游离DNA（cfDNA），结果显示其中4位有AA突变特征（图5C）。为了进一步验证cfDNA检测结果，作者对8位UTUC患者（包括4位有AA突变特征的患者和4位没有AA突变特征的患者）进行了全基因组测序。结果表明（图5D），4位有AA突变特征的患者肿瘤组织中检测到了高比例的AA突变特征（＞50%），而4位没有AA突变特征的患者则几乎没有检测到AA突变特征（＜5%）。因此，作者提出cfDNA中检测到AA突变特征可以提示患者属于预后相对良好的AA Sig亚型。
图5.AA突变特征可作为分子指纹提示患者属于AA Sig亚型
小结
作者对90例UTUC样本进行全基因组测序，并按照COSMIC数据库中已解析的突变特征对所有样本进行层次聚类分析，分为AA Sig和NO-AA Sig两个亚型。结果发现，AA突变特征占比高的UTUC患者（即AA Sig亚型）AA中草药暴露比例较高。Kaplan-Meier生存分析显示AA Sig亚型患者预后较No-AA Sig亚型更好。作者根据AA Sig亚型多病灶UTUC患者测序结果推测，区域癌化和管腔种植可能共同促进AA Sig亚型患者的肿瘤多病灶和膀胱复发。此外，AA Sig亚型肿瘤还具有较高的肿瘤突变负荷、肿瘤新生抗原数目和免疫细胞浸润，提示AA Sig亚型患者可能是肿瘤免疫检查点阻断疗法的潜在人群。最后，作者发现利用低深度全基因组测序，可在cfDNA中检测到AA突变特征，从而提示患者属于预后相对良好的AA Sig亚型，由此实现早期诊断和无创检测。
然而根据作者报道，多灶性AA Sig亚型患者预后良好，这与最新欧洲泌尿外科学会（EAU）指南中多灶性患者为预后高危人群的内容相驳。因此，作者的研究仍需更大样本量、更长随访时间的队列研究进行进一步验证。