科研 | Developmental Cell：单细胞分析揭示了小鼠肾脏的性别、谱系和区域多样性（一区IF：9.19）

编译：不二，编辑：十九、江舜尧。

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导读

全球10%的人受慢性肾脏病困扰，并且不同种族和性别的人群对肾损伤及肾病的易感性明显不同。肾功能不全会导致其他器官明显的发病率、死亡率以及慢性疾病。对小鼠器官的理解是人类疾病建模和细胞方法修复受损器官得以快速发展的基础。为了增强对哺乳动物肾脏的了解，研究者在解剖学指导下对成年雄性和雌性小鼠肾脏进行单细胞RNA测序，并结合了基因原位表达研究和细胞谱系追踪。这些研究结果揭示了肾脏的细胞多样性和性别差异，肾元的不同区域及细胞组成分别依赖于肾元的分化及细胞谱系的融合，其中相邻功能相关的细胞类型是从肾元和收集系统祖细胞群体分化而来的。

论文ID

原名：Single-Cell Profiling Reveals Sex, Lineage, and Regional Diversity in the Mouse Kidney

译名：单细胞分析揭示了小鼠肾脏的性别、谱系和区域多样性

期刊：Developmental Cell

IF：9.19

发表时间：2019.11

通讯作者：Andrew P. McMahon

通讯作者单位：美国南加州大学凯克医学院

实验设计

组织样本：肾脏组织取自2只成年C57BL/6J品系雄鼠和2只成年C57BL/6J品系雌鼠（9-10周龄），使用冷DPBS缓冲液进行灌注去除血细胞，利用手术器械解剖获得皮质、外延髓和内延髓组织。所有操作均在冰上进行。

单细胞分离和测序：使用裂解缓冲液和蛋白酶等分离细胞。样品进行匀质，过滤，离心，制成细胞悬液。制备10X Chromium文库，使用Illumina HiSeq 4000平台测序。

生物信息学分析：测序数据经过质量过滤后，使用STAR aligner软件比对到小鼠参考基因组上（mm10），使用R语言Seurat（v2.3.4）、ggplot2（v3.0）、Matrix（v1.2-14）和dplyr（v0.7.5）对输出的基因表达矩阵进行主成分分析和表达基因的鉴定。功能基因的富集使用PANTHER在线分析。

肾脏的免疫组化和原位杂交分析：免疫组化使用各个基因特异的抗体进行，原位杂交使用RNAscope试剂盒按照说明书进行。通过共聚焦显微镜获得图像，调节图像的亮度、对比度和透明度，来优化细胞图像分布的分辨率。

实时荧光定量PCR：使用RNeasy试剂盒进行RNA抽提，使用Superscript Vilo试剂盒进行逆转录，使用SYBR green的方法在ABI 7500实时荧光定量PCR仪上进行基因定量。

图片摘要

在线搜索数据库-肾脏细胞浏览器（Kidney Cell Explorer，https://cello.shinyapps.io/kidneycellexplorer/）可以在肾脏的解剖结构中查看基因-细胞类型的关系。

结果

解剖学指导的小鼠肾脏测序分析

基于多种因素的考虑，研究者利用图1A中所示的方法对肾脏进行单细胞分析。第一、scRNA-seq分析应先鉴定性别。第二、在细胞分离前将肾脏细分为不同的解剖学区域，这将有助于恢复代表性细胞的区域，快速将细胞映射到对应的肾组织的解剖结构。第三、scRNA-seq数据的测序深度和质量应允许其他细胞异质性的识别，同时最大程度地减少组织分离时的误差。第四、基于scRNA-seq结果二次验证的预测将最终创建这些数据基于解剖结构的在线搜索视图。

成年雄性和雌性小鼠肾脏区域进行显微解剖后，对单细胞分离进行了优化，以获得具有保守的细胞组织和具有细胞多样性区域特征的细胞样品（图1A）。将两只成年雄性和雌性C57BL6/J小鼠的皮质（区域1）、外延髓（区域2）和内延髓（区域3）制作成单细胞悬液，使用Illumina Hi-Seq的10X Genomics Chromium平台进行单细胞文库构建。测序结果显示每个肾脏平均有10178个细胞及7.17亿测序数据量，平均每个细胞中含有1395个基因。

差异表达基因的分析合并了12个基因矩阵，每个矩阵都标注了重复、区域和性别的起源。过滤了较差的数据后，使用Seurat R程序包进行聚类分析，得到了31265个细胞图谱，数据显示为二维tSNE图（图1B），并列出了最大差异表达基因的列表。通过将富集的基因集与肾细胞类型特异性标记相匹配进行注释，由此初步分析产生30个不同的细胞簇，将数据集分为五个主要谱系部分（图1C）。尽管在几个近端肾小管相关的细胞簇中有明显的性别偏好（图1D），但大部分细胞簇聚类重复性都较好。区域分析与预期结果匹配性良好：近端肾小管、远端曲小管和皮质收集管位于区域1，而Henle长细环和内部髓质收集管都位于区域3（图1E）。总而言之，最初的聚类分析证明了整个数据集的可重复性，同时强调了细胞簇间肾元和区域多样性的性别差异。

鉴于这种连续的上皮网络在肾生理学中的关键作用，随后的分析着重于增进对肾元和输尿管上皮区域的了解。在胎儿期和出生后早期发育中，肾元和输尿管上皮祖细胞的分化产生了具有不同功能的上皮节段，这些上皮节段沿肾脏的皮层髓核轴呈放射状排列。在肾小体中产生的原始肾脏滤液通过近端肾小管、Henle长细环和远端肾小管节段到达输尿管上皮衍生的收集系统（图2A）。连接肾元和输尿管网络的区段起源尚不明确。发育学研究表明，输尿管上皮、肾元祖细胞或者两者的混合种起源于两种谱系。谱系分配也具有一定的困难，细胞簇12（Calb1⁺/Slc12a3⁺）和细胞簇20（Calb1⁺/Hsd11b2⁺/Aqp2⁺）都显示出标记基因Calb1的高水平表达，但是它们分别被注释到肾元和输尿管上皮组（图1B和1C）。

图1 成年小鼠肾脏中细胞多样性的解剖图

肾脏结构的性别多样性

通过Seurat软件几次迭代分析重新分配指定的肾元细胞类型，解析了18个细胞簇（图2B）。使用细胞簇高表达基因来鉴定细胞类型（图2C）。令人惊讶的是，尽管所有肾脏样品均能代表大多数细胞簇，但所有近端肾小管细胞簇却按性别分开（图2D）。与此发现一致的是，肾脏性别相关性研究在显示两性差异主要在近端肾小管区域。细胞簇0、2、3和5主要位于皮层中（图2E），并直接按照性别偏好分开。细胞簇9形成了大型雌性（298个细胞）和小型雄性（32个细胞）分组，分别称为9和9m（图2B–2D）。在与近端肾小管功能相关的许多基因类别中，发现许多基因表达存在性别差异，包括有机阴离子（Slc22a6和Slc22a8）和氨基酸（Slc7a12和Slc7a13）的转运基因，药物（Fmo5和Cyp4a14）、胆固醇（Cyp7b1）和激素（Agt和Hsd17b2）的代谢基因。

为了绘制性别双态结构域，研究者分别鉴定了在雄性和雌性（Xist⁺）细胞簇中具有高表达的基因，并将其表达与近端肾小管的节段组织的基因进行了比较得到：Spp2/Slc5a2（S1区）、Slc34a1（S1-S2区）和Slc22a7（S3区）（图2F）。两性之间基因活性的最高差异是在S3区。例如，Slc7a12和Cyp7b1转录本分别位于Slc22a7⁺S3区的雌性（9）和雄性（9m）子集中（图2G）。成年小鼠肾脏的cDNA的qPCR分析证实了性别二态性基因的活性（图2H）。为了使在近端肾小管中基因表达可视化，利用标记的RNAscope探针对成年雄鼠和雌鼠的肾脏切片进行了原位杂交。如预期的相同，在Aqp1⁺近端肾小管的Slc22a7⁺S3区中，Slc7a12显示雌性高表达，而Cyp7b1显示雄性高表达（图2I）。此外，对Slc34a1、Cyp2e1和Cyp4a14转录本的共同分析，结果显示Slc34a1⁺近端肾小管的S2区中Cyp2e1（仅雄性）和Cyp4a14（仅雌性）基因的性别特异性表达（图2I）。

这些发现与早期的肾脏性别差异研究非常吻合，并进一步增加了性别差异的表达基因和细胞类型。目前，尽管人体肾脏活检分析表明存在性别差异，但仍然没有可以比较的人肾脏scRNA-seq数据。然而，小鼠和人类都表现出男性偏向于缺血引起的肾脏损伤，其中S3区特别容易受到损伤。对应激诱导的细胞死亡的易感性可能解释了为什么在scRNA-seq图谱中男性S3区明显的代表性不足（图2I）。

尽管还需要进行其他研究来确定性别差异和人类相关性的显著性，一些差异的发现也令人惊喜。例如，催乳激素受体（Prlr）在雌性S3区优先表达（图2F，2H）。这些数据表明，Prlr驱动的肾功能调节对母亲、子代或两者都有益处。在哺乳动物中，孕妇和哺乳期女性产生的催乳素通过Prlr调节乳腺的乳汁分泌和下丘脑的行为。在人类和大鼠中进行的功能研究已将催乳素与近端肾小管中的盐水控制联系起来，而进化学研究表明催乳素和钠盐调节存在联系。其他S3区富集的雌性基因与激素代谢有关（包括Dio1、Ttr、Akr1c18、Gm4450、Spp1和Rdh16）和与肾脏损害或疾病相关（包括Spp1、Lrp2和Cubn）。

图2 成年小鼠肾脏肾元的性别多样性

肾元细胞的时空多样性

小鼠肾脏的14000个肾元是通过从胎儿和新生儿的长期发育中的祖细胞中反复诱导产生的。近髓肾元的肾小体靠近皮质-髓质边界，内延髓核区深处为Henle长细环，而皮质肾元有周围皮质局部性肾小体，Henle短环位于外延髓（图3A）。长环和短环具有各自独特的生理作用，尿液浓度与近髓肾元的长环相关。由于对肾元类型、起源和细胞多样性的研究有限，使得对该区域的注释成为一个特殊的挑战。

为了解决肾元起源的问题，使用Wnt4^CRE-ERTM小鼠品系，在胚胎第15.5天或出生后第2天激活肾元前体中的红色荧光报告基因（tdT）的表达（图3B）。早期标记为近髓肾，晚期标记为皮质肾，这与肾皮质生长的时空进展一致（图3B）。接下来，发现Henle环特异的细胞簇（图3C），鉴定了在每个簇中都有丰富表达的基因（图3D），然后将基因活性映射到早期和晚期的tdT⁺细胞形成的肾元类型（图3E和3F）。

近髓肾元在外延髓区中从S3区外带中的Aqp1⁺/Slc7a13⁺细胞过渡到Henle环内带中的Aqp1⁺/Fst⁺细胞（图3C-3E）。从外延髓到内延髓，沿着Henle环分布着几种不同的细胞类型：Aqp1⁺/Slc39a8^high细胞（细胞簇12）、Aqp1⁺/Slc39a8^low细胞（细胞簇6）和Aqp1^-/Sptssb⁺细胞（细胞簇4和14）（图3C-3E）。Clcnka⁺/Sptssb⁺/Crlf1⁺细胞（细胞簇15）是从Henle环的细肢到其与外延髓远端肾小管厚肢的交界处（图3C-3E）。

在皮质肾元中，用Gdf15^CRE-ERTM小鼠品系进行细胞命运定位，S3区外延髓外带中的Aqp1⁺/Slc7a13⁺细胞转变为Aqp1^-/Gdf15⁺细胞（图3F）。在连接到Henle环的厚肢之前，Gdf15⁺区域转变为外延髓内带的Slc14a2⁺区域（图3C，3D，3F）。

示意图模型显示了Henle环与肾元类型细胞多样性的关系（图3G）。Henle环的功能获得对于哺乳动物的成功辐射至关重要。低肾元数与肾脏疾病有关，并且肾元数的下降可能会优先影响后来的皮质肾元的形成。基因富集分析可以解析与近髓和皮质肾元的特定细胞类型相关的不同功能和潜在调控作用（图3H）。Henle环的细肢中较晚形成的皮质肾元（细胞簇13）显示出转录调控因子（Id1、Id3、Foxc1和E2f2）和信号分子（Jag1、Gdf15、Spry1和Fstl1）的高表达，这表明控制区域性细胞特性和局部细胞相互作用的机制（图3H）。Corin基因编码一种对调节血容量和血压至关重要的丝氨酸肽酶，它在皮质肾元特异性细胞群中特异表达，人类中Corin基因的变异与高血压、心脏肥大和子痫前期有关。

图3 与发育时间相关的Henle环细肢的细胞命运和解剖图

收集系统中的区域多样性

收集系统的输尿管上皮在时间和区域上与肾元祖细胞谱系起源不同（图4A）。使用Seurat软件重新注释聚类的输尿管上皮细胞，包括来自皮质连接肾小管的主要数据集（图1B和1C），解析了16个细胞簇，细胞数量从61到543个（图4B）。基因富集分析（图4C）结合关键细胞类型的区域预期分布分析（图4D）有助于鉴定每个细胞簇。

Aqp2⁺和Aqp3⁺/Aqp4⁺主细胞（PC）可调节水和盐含量来响应激素输入。但是，在注释为主细胞特征的细胞中观察到了惊人的多样性（图4B和4C）。多样性至少部分与沿着皮质髓质轴的区域有关（图4D）。对这些细胞簇之间特定基因谱的分析（图4C）显示，皮质细胞簇9和6以及髓质细胞簇13和10与髓质细胞簇2、5、12、0、3、4和1共享类主细胞样特征，但有些基因表达与主细胞又不同。将细胞簇9、6、13和10指定为类主细胞（PLC），其中Kcne1和Atp4a基因用于区分皮质类主细胞，Lamb3和Plat基因用于区分内延髓收集系统类主细胞（图4B和4C）。除了区域偏好，在主细胞群集之间也观察到明显的性别偏好（图4E）。总体而言，这些数据表明小鼠肾脏中主细胞的转录状态存在明显的区域和性别相关差异。

闰细胞（IC）在酸碱和电解质稳态中起重要作用。其中，一般分为三种闰细胞类型：Slc4a1⁺闰细胞-A沿整个皮质髓核轴分布；Slc26a4⁺闰细胞-B仅局限在皮质区域；以及截然不同的根据细胞形状和跨膜蛋白膜极性来区分的皮质“非A-非B”闰细胞。聚类分析确定了两个不同的闰细胞-A（细胞簇7和11）和两个闰细胞-B（细胞簇8和15）细胞群，这些群集表现出预期的区域限制（图4B和4D）。通过对闰细胞簇间的Hox基因表达检测，进一步了解了这些细胞簇。Hox基因的活性与沿人体轴上细胞形成的时间和区域有关。输尿管上皮和肾元祖细胞出现在中胚层的不同时间和区域，前者在胚胎发生中更早地定位在前端的区域。Hox基因活性失调会导致肾脏表型显著变化，表明Hox基因活性对肾脏发育至关重要。Hox基因的活性与沿着主体轴逐渐增多的后端结构相关，可以增进对特定细胞簇的组织起源的了解。图4F中细胞簇内Hox基因表达谱的比较显示，每个簇具有两个不同表达谱中的一个，这些表达谱通过大多数Hox基因的表达来区分。值得注意的是，只有皮质闰细胞-A细胞簇11、闰细胞-B细胞簇8和类主细胞簇9表达Hox10基因（图4F）。对于胚胎发育中这些谱系时空序列相关性的建立，这些发现可以解释闰细胞和类主细胞分别从后端肾元祖细胞（Hox10⁺）和前端输尿管祖细胞（Hox10^-）中产生。

图4 输尿管上皮的解剖结构、性别和细胞多样性

肾元收集系统交界处的谱系多样性

为了了解闰细胞、主细胞和类主细胞的起源，研究者将肾元和收集系统交界处可视化，通过用tdT报告基因标记所有肾元祖细胞（图5A）以及用Venus报告基因标记所有输尿管细胞（图5A）。tgHoxb7-Venus报告基因在血管细胞中也表达较弱，很容易与收集系统区分开。在肾元形成的早期阶段，远端肾元中存在低Venus信号，Hoxb7-GFP报告基因也有类似的结果。虽然Venus基因的表达水平可以容易地区分发育中的肾脏细胞起源，但在成年鼠中，交界处的细胞起源没有模棱两可的地方。尽管交界处显示出不同的tdT⁺和Venus⁺细胞混合状态，但是每种标记蛋白都有明显的分离（图5B-5D）。靠近边界区域的罕见的tdT⁺/Venus⁺共标记细胞可能是由于细胞融合或报告基因错误表达（图5C）。正如从单细胞数据预测的那样，Hoxd10⁺细胞始终是tdT⁺阳性信号，表明这些细胞完全如预测的那样来自肾元（图5D）。Aqp2⁺类主细胞和Atp6v1b1⁺闰细胞的免疫原位杂交显示两种细胞类型都有tdT⁺和Venus⁺标记（图5E）。因此，肾元和输尿管对交界处的闰细胞和类主细胞都有贡献。

已有的报道表明主细胞和闰细胞的命运取决于Notch信号通路Jag1基因的调控作用和Tfcp2l1基因的转录作用。对于Jag1基因（受闰细胞-B限制）和Tfcp2l1基因（广域的闰细胞和较弱的类主细胞）的分析显示，其活性与它们的来源无关。这表明以输尿管和肾元谱系确定类主细胞和闰细胞命运的相似机制（图5F）。类似地，源自两种谱系的细胞中均存在专门区分闰细胞-A或闰细胞-B的蛋白（分别为Slc4a1和Slc26a4/Jag1）（图5G和5H）。

为便于解析交界处的细胞类型，将来自远端肾元和输尿管谱系的所有皮质细胞簇进行亚群划分（图5I），并为每个细胞簇鉴定差异表达的基因标记（图5J）。除了提供对闰细胞种群的进一步了解之外，亚群研究还鉴定了肾元的Slc12a3⁺远曲小管内Ckb⁺细胞的新亚群。类主细胞分为以肾元（Aqp2⁺/Hoxd10⁺细胞，细胞簇2）或输尿管（Aqp2⁺/Hoxd10^-细胞，细胞簇1）为主的细胞簇（图5I，5J）。皮质闰细胞-A形成了Slc4a1⁺/Hoxd10⁺肾元来源的闰细胞-A类型的单细胞簇（细胞簇5）和髓质闰细胞-A类型不同的输尿管衍生的Slc4a1⁺/Hoxd10^-细胞簇（图5I，5J）。闰细胞-B以阴离子转运蛋白Slc26a4的表达来区分。Slc26a4⁺细胞分为肾元来源的（Hoxd10⁺）细胞簇3和输尿管来源的细胞簇7（图5I，5J）。有趣的是，铵转运蛋白Rhbg的表达区分了细胞簇3和7。Slc26a4和Rhbg的共表达是非A-非B闰细胞的特征。此外，大约20％的Slc26a4⁺/tdT⁺细胞显示Rhbg阴性，表明肾元祖细胞也产生了闰细胞-B。

为了找到交界处内细胞类型的独特基因标记，对Aqp2和Slc26a4基因进行了相关性表达分析，将Aqp2⁺/Hoxd10⁺与Aqp2⁺/Hoxd10^-细胞以及Slc26a4⁺/Hoxd10⁺与Slc26a4⁺/Hoxd10^-细胞进行了比较，然后在所选基因之间进行了二级相关性分析（图5K和5L）。预测的类主细胞标记基因分别为肾元谱系Slc2a9基因和输尿管谱系Ache基因，而Sh2db4基因将闰细胞-B与其他细胞类型区分开（图5M），并用RNAscope原位杂交进行了验证。

图5 皮质类主细胞和闰细胞类型的双重起源

总而言之，这些数据表明肾元到收集系统的细胞类型和细胞起源的多样性，该区域对于激素介导的钠调节和钙吸收至关重要（图5N）。肾元祖细胞产生类主细胞、闰细胞-A、闰细胞-B和非A非B闰细胞，而皮质输尿管上皮祖细胞产生类主细胞、闰细胞-A和闰细胞-B。与输尿管上皮祖细胞来源的髓质闰细胞-A和主细胞/类主细胞相比而言，来自皮质类主细胞和肾元与输尿管谱系的闰细胞-A彼此更相似。类主细胞和闰细胞类型的双重起源特别引人注目。当小鼠和人类上皮肾元前体从肾小管转变为与输尿管上皮连接的S形时，远端区域逐渐采用类似于相邻输尿管上皮的转录调控信号，包括激活对于闰细胞命运至关重要诸如Tfcp2l1的调控因子。这些数据表明，体内远端肾元进行了重新编程，使其类似于输尿管谱系。这些发现对恢复人类肾脏功能的再生策略具有重要意义。远端肾元的可塑性和细胞异质性可消除对输尿管上皮衍生细胞类型共同发育的需求。

图6 肾脏细胞浏览器Kidney Cell Explorer视图-成年小鼠肾脏中细胞多样性的基因搜索图

结果

将单细胞分析与遗传图谱相结合，可深入了解哺乳动物肾脏中细胞、区域、谱系和性别相关的多样性。具有代表性的细胞类型采样以及将单细胞数据与器官的功能解剖结构重新关联并非易事，而且肾脏的复杂性使其成为一个特殊的挑战。研究者采用的显微解剖和细胞分离策略能够优化区域细胞的恢复，同时保留对细胞多样性至关重要的结构组织解剖图谱的关键特征。研究数据为注释人肾中的细胞类型和细胞多样性提供了有力的依据。尽管物种之间会有差异，小鼠和人类肾脏的早期发育过程伴随着各自独特的基因活性，性别双态基因活性可能会引起这种强烈的物种偏好。但是，细胞类型和细胞定位的总体框架可能会得到很好的保留。

还有许多其他方式可以有效地挖掘这些数据。例如，通过对肾脏特定细胞类型的高表达基因分析，可以加深了解在肾元和输尿管的上皮细胞。已有研究显示包含肾元近端、中段和远端节段的细胞基因转录间的关系，这表明了肾元结构在发育中的关系。在沿收集系统上皮的轴向也观察到类似的结果。研究者的方法经过了优化，可以恢复肾元和收集系统上皮细胞，这些细胞直接与血浆滤液相互作用。显然，在本研究和其他单细胞分离过程中足细胞的不足，对单细胞和单核方法进行肾细胞表达谱的比较分析表明，每种方法都会引入各自的偏好。但是，对血管和免疫细胞数据集的初步分析表明，这些细胞测序数据是可靠的，并且对其进行详细分析有望获得有趣的新见解。

本研究生成了一个简单的可在网上搜索的数据库-肾脏细胞浏览器Kidney Cell Explorer，通过结合tSNE分析（图6A-6C）和注释的肾元与输尿管上皮图谱（图6D-6F），使基因表达模式可视化。这些模型结合单独的细胞簇数据对每个解剖组创建了一个强大的“元细胞”（图6F），包含了9000-15000个表达的基因（图6G）。通过基因名称搜索，可以在每个主要和次要细胞簇中查看单个基因表达数据（图6A-6C），并可以生成近髓肾元和皮质肾元的基因表达热图。此外，批量搜索选项可以比较每个“元细胞”分组中的多个基因（图6E）。

作为此方法实用性的说明性示例，作者展示了与激素调节、肾脏疾病（肾病综合征）和介导肾脏的生理活动相关基因的分布。有趣的是，足细胞中高水平表达的Pth1r基因表明它的骨刺激配体PTH在治疗骨质疏松症中具有潜在的脱靶作用。关于性别差异方面，雌性相比于雄性近端肾小管的睾丸激素受体（Ar）和生长激素受体（Ghr）的表达水平较高，但雌激素受体（Esr1）的表达水平较低。此外，在近端肾小管区域编码主要血压调节酶Ace和Ace2转录本的表达显示出明显的性别差异。血浆滤液通过近端肾小管时，调节其吸收或分泌的多种基因表达也有明显的性别差异。近端肾小管细胞在药物的运输和排毒中起关键作用。有趣的是，在雄性和雌性近端肾小管中，药物和毒素转运过程中起关键作用的Slc22a6基因和几个Slc22阴离子转运蛋白基因家族的其他成员都有各自不同的表达。鉴于对药物和毒素易感性研究的潜在影响，这些结果强调需要更深入地了解人肾脏内的性别多样性。研究者对肾脏疾病的细胞起源鉴定结果与近期的报道一致，足细胞是肾病综合征基因的主要靶标，但本研究对可能会影响许多其他细胞的疾病基因提供了更多的见解。

评论

总之，肾脏细胞浏览器Kidney Cell Explorer将促进学术和临床研究团体访问本研究数据以及对这些数据进行分析。此外，研究者采用的总体策略为生成人类肾脏的细胞图谱提供了一个框架。从长远的角度来看，这些数据突出了有待进一步研究的关键领域：早期和晚期形成的肾元中如何产生不同的细胞类型，在肾元与收集系统肾小管交界处如何协调细胞多样性的分子过程，以及近端肾小管如何获得性别多样性的分子机制。

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