基因敲除技术的策略

利用CRISPR-Cas9系统来实现编码基因的敲除，可以有两种策略，分别是移码敲除和片段敲除。其最为直观的区别是使用sgRNA的数量不同。当使用一条sgRNA在蛋白编码基因的外显子内产生DSB时，若NHEJ修复导致了缺口处产生了非3倍数的indels，则会造成蛋白翻译时的读码框移码（Frameshift），不再产生完整的蛋白，即移码敲除。而使用两条sgRNA同时作用造成两个DSB时，NHEJ修复不但可造成染色体DNA片段的缺失，同时也可能造成读码框移码，即片段敲除。

图1. 使用CRISPR-Cas9进行基因敲除示意图

如今，这两种策略已经广泛应用于基因敲除的细胞系构建。如Haq等为了研究编码基因USP 28的功能，于是在USP 28的第二个外显子处设计了两条sgRNA，希望通过片段敲除的策略实现突变USP 28的功能。并且在后续的Western Blot检测也验证了敲除细胞系中已无USP 28蛋白表达（图2）。Wu等研究BECN1的功能时，选择用移码敲除的策略。在方案设计阶段设计3条sgRNA，通过荧光素酶等实验确定了sgRNA-1的效率最高。然后将sgRNA-1包装感染MDA-MB-231细胞的慢病毒。再对构建的BECN1敲除细胞系进行测序鉴定与Western Blot检测。结果表明敲除细胞系中已无BECN1蛋白表达（图3）。

图2. 利用片段敲除策略敲除USP 28（Haq et al., 2019）

图3. 利用移码敲除策略敲除BECN1（Wu et al., 2018）