多肽酰肼的制备

多肽酰肼是指在多肽化学合成中，将多肽的C末端由常见的羧酸或者酰胺转化为酰肼。由于酰肼结构的特殊活性，主要是有以下用途：一是通过形成schiff碱或者亚胺形成腙，来对多肽进行选择性的标记。另一种是在自然化学连接中，作为C端硫脂的替代物，通过NaNO2氧化，转硫脂化等过程，变化为硫脂后，与N端半胱氨酸多肽片段进行正常自然化学连接即可。因此，多肽酰肼的制备在多肽和蛋白质化学合成中有着重要的应用。

固相合成是主流的获取多肽片段的方式，包括Fmoc和Boc固相合成。通过将氨基酸C端羧酸固定在固相树脂上后，从C端到N端逆向进行氨基酸缩合，从固相上裂解并脱保护后最终获得正确序列的多肽。因此，获取C端酰肼多肽的关键，主要是通过对固相负载的linker进行改造。下面，对多肽酰肼的一些制备方法进行介绍。

基于wang resin

2011年，Ge-Min Fang 等人对wang resin进行改造，合成多肽酰肼结构。在二氯甲烷溶剂中，通过将1.5 g，0.46 mmol的wang resin与1.44 mmol 4-硝基苯基氯甲酸酯和 160 μL N-甲基吗啉室温下进行反应，过夜后得到4-硝基苯基碳酸 wang resin。随后将获得的树脂洗涤干净，与3.14 mmol 水合肼室温下过夜搅拌反应后，再通过二氯甲烷，甲醇等溶剂清洗后即可获得肼-wang resin。通过该策略，他们验证该酰肼结构在自然化学连接中的扩展性，并成功合成了trifolitoxin，centruroides suffusus  ΙΙ以及microtubule-associated protein light chain 3。

2014年，Claudia Bello等人同样基于wang resin制备多肽酰肼。他们的方法比较直接：在wang resin上进行固相合成后，直接使用5%的水合肼/甲醇溶液进行树脂裂解，将C端直接变成酰肼结构，随后再使用TFA cocktail进行脱除后，即可获得多肽酰肼结构。

基于2-CTC resin

2-CTC resin是Fmoc固相合成中用来获取C端羧酸的常用固相负载，它也被发展用来获取多肽酰肼。1995年， George Stavropoulos等人将40 mmol 2-CTC resin与2倍当量的水合肼以及3倍当量的三乙胺进行反应，室温下搅拌60 min后，继续加入4 mL的甲醇来对未反应的resin进行封闭。使用DMF，甲醇，乙醚等溶剂洗涤，烘干后，即可获得肼2-CTC resin 。但是该resin易受湿气和空气影响，不能长期保存。2014年，Yi-Chao Huang 等人在此基础上，将2 g 0.57 mmol/g 2-CTC resin与4倍当量的Fmoc-肼以及10倍当量的二异丙基乙基胺在24 mL DMF/DCM (5:1)进行过夜反应，随后加入0.32 mL的甲醇进行树脂封闭。通过甲醇，DMF等试剂清洗，真空干燥后，获得了Fmoc-肼-2-CTC resin，并能在4℃下保存数月。

基于hydrazone resin 

Hydrazone resin是2014年，Pavel S. Chelushkin等人发展出来的合成多肽酰肼的树脂。结构如图所示。该树脂能够完全兼容标准的Fmoc固相合成过程，同时由于耐受5%TFA/DCM，可以在树脂上脱除mtt（methyltrityl）以及其他酸敏感保护基团。合成时，氨基树脂可以相继与丙酮酸-琥珀酰亚胺（Pyv-OSu）和Fmoc肼发生反应，也可在DIC/HOBt活化下，直接与Fmoc-NH-N=Pyv-OH反应，生成Fmoc-hydrazone resin。通过哌啶进行脱保护后，再进行第一个氨基酸缩合。从文章第一个氨基酸的反应活性来看，最高的转化效率为89%，仍待进一步提高。这种腙树脂的开发，丰富了多肽酰肼的合成策略，并可应用于侧链酸敏感基团选择性脱除的多肽合成。

基于ChemMatrix resin

2014年，Katrine Qvortrup等人报道了基于ChemMatrix树脂改造的制备多肽酰肼的树脂，裂解方式并非传统的酸解或者碱解，而是通过365 nm LED光照。制备过程如下：首先通过有机合成方式获取光控linker（1），通过TBTU缩合至树脂上。其上的Boc保护基通过TMSOTf/2,6-lutidine进行脱除后裸露肼，再正常进行Fmoc固相合成。合成完成后使用365 nm光照从树脂上裂解释放C端酰腙，随后水解获得全保护多肽酰肼，再进行侧链脱保护后即可获得多肽酰肼。该策略丰富了多肽酰肼的制备途径，同时也是获得全保护多肽酰肼的可选方法之一。此外，该策略也为合成药理学相关的杂环化合物提供了一个新的思路。

参考文献：

1. Huang, Yi-Chao, Ge-Min Fang, and Lei Liu. 'Chemical synthesis of proteins using hydrazide intermediates.' 2016, Nat. Sci. Rev., 3 (1) : 107-116.

2. Fang, Ge‐Min, et al. 'Protein chemical synthesis by ligation of peptide hydrazides.' 2011, Angew. Chem., 123 (33) : 7787-7791.

3. Huang, Yi-Chao, et al. 'Facile synthesis of C-terminal peptide hydrazide and thioester of NY-ESO-1 (A39-A68) from an Fmoc-hydrazine 2-chlorotrityl chloride resin.' 2014, Tetrahedron, 70 (18): 2951-2955.

4. Stavropoulos, George, et al. 'Preparation of polymer-bound trityl-hydrazines and their application in the solid phase synthesis of partially protected peptide hydrazides.' 1996, Lett. Pept. Sci., 2 (5): 315-318.

5. Chelushkin, Pavel S., et al. 'Convenient method of peptide hydrazide synthesis using a new hydrazone resin.' 2015, Tetrahedron Lett., 56 (4): 619-622.

6. Qvortrup, Katrine, Vitaly V. Komnatnyy, and Thomas E. Nielsen. 'A Photolabile Linker for the Solid-Phase Synthesis of Peptide Hydrazides and Heterocycles.' 2014, Org. lett., 16 (18): 4782-4785.

7. Bello, Claudia, Frauke Kikul, and Christian FW Becker. 'Efficient generation of peptide hydrazides via direct hydrazinolysis of Peptidyl‐Wang‐TentaGel resins.' 2015, J. Pep. Sci., 21 (3): 201-207.