科研 | J. Immunother. Cancer：人类肿瘤诱导的巨噬细胞中脂质生物合成的增强有助于它们的瘤前特性
编译：yy，编辑：Emma、江舜尧。
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肿瘤微环境(TME)在细胞群体上具有异质性：除了肿瘤细胞本身、内皮细胞和成纤维细胞外，免疫炎症细胞群体在TME的形成中也起着重要作用。炎症和免疫逃避是癌症的两个特征，是肿瘤生长和肿瘤进展的重要原因。肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)是TME中含量最丰富的天然免疫细胞之一。它们与肿瘤细胞有着重要的相互关系，因为肿瘤细胞调节巨噬细胞的功能，从而有助于TAMs的编程，进而影响肿瘤细胞的行为。从理论上讲，巨噬细胞有能力在肿瘤清除中发挥有效作用，然而，在已建立的肿瘤中，TAMs促进癌细胞存活、增殖、转移、血管生成和免疫抑制。
巨噬细胞的一个关键特征是它们的可塑性，使它们能够通过调整细胞代谢和转录程序来适应环境的变化。在TME中，浸润的单核细胞遇到来自肿瘤细胞的信号，导致代谢编程和功能适应，因此，肿瘤细胞培养TAM以获得肿瘤支持表型。此外，在许多类型的癌症中，TME中高密度的TAMs与预后不良有关，这支持TAMs的瘤前功能。人们对理解TAMs的肿瘤前表型的细胞通路很感兴趣。因此，干扰TAMs中的这些通路可能是一种很有前途的新的治疗策略。
在过去的十年中，免疫代谢领域已经提供了关于免疫细胞代谢概况和细胞代谢塑造免疫细胞激活状态和功能的机制的数据。例如，在体外，经典激活的M1巨噬细胞使用无氧糖酵解、蛋白质和脂肪酸(FA)合成代谢途径，而交替激活的M2巨噬细胞主要使用氧化磷酸化(OXPHOS)进行能量代谢，然而人们对人类巨噬细胞在癌症背景下的编程和特定代谢表型知之甚少。在目前的研究中，作者目的是在非髓样甲状腺癌(TC)和神经母细胞瘤(NB)的背景下研究TAMs的代谢和功能特征。已知TC和NB均被巨噬细胞浸润，这与预后有关。
在早期的工作中，使用一种基于发现的方法对人TC诱导的巨噬细胞进行转录组分析，发现代谢编程是这些巨噬细胞的一个关键特征。已发现的糖酵解和OXPHOS的变化通过代谢方法得到验证。正如对小鼠巨噬细胞的研究表明，除了主要的能源葡萄糖之外，脂质的代谢可能在巨噬细胞的分化和极化中发挥重要作用。在这里，显示了人类肿瘤诱导的巨噬细胞的特征也是FA合成的增加，这影响了重要的免疫功能。此外，这些发现不是TC特有的，也可以在NB诱导的巨噬细胞中观察到。总而言之，这些关于TAMs代谢程序的新发现可能具有识别恶性肿瘤的新治疗方法的潜力。
论文ID
实验设计
实验结果
1. 转录组分析：肿瘤诱导的巨噬细胞FA合成上调
在之前的研究中，将TPC-1细胞系在间接transwell共培养体系中培养24小时，通过对TC诱导的巨噬细胞进行RNA测序，生成了全基因组转录组数据。比较对照单核细胞和肿瘤诱导巨噬细胞的转录组。细胞在低糖(5mM)的无血清培养基中培养，以避免外源性代谢物对细胞内代谢的影响。24小时后，用Toll样受体4(TLR4)激动剂LPS刺激或以培养基为对照刺激4或24小时(见图1A中的实验设置)，模拟损伤细胞释放内源性TLR配体,如濒临死亡的肿瘤细胞。作为这个数据集的第一个分析，报告了依赖mTOR的有氧糖酵解和炎症相关途径在TC诱导的巨噬细胞中富集。
在目前的研究中，作者关注的是标志性途径“FA代谢”的强烈富集，该途径在4小时的时间点上富集。利用反应组法计算富集，发现“超长链脂肪酸合成”和“过氧化脂质代谢”途径在4小时时富集，而脂质相关途径“鞘磷脂代谢”、“高密度脂蛋白介导的脂质转运”和“磷脂代谢”在24小时时富集(图1B)。有趣的是，在用TLR4激动剂LPS刺激24小时后，发现更多的脂质相关途径被富集，主要与脂质或FA的从头生物合成有关(图1)。
为了验证转录组数据，对最显著上调的脂质相关基因做了qPCR。证实在TC诱导的巨噬细胞(TPC-1和FTC-133)中，FA生物合成(FASN和ACACA)和FA去饱和(FADS2)的关键酶表达上调。作者还将研究扩展到NB诱导的(SK-N-AS和IMR-32细胞系)巨噬细胞，因为NB是另一种已知的被巨噬细胞高度浸润的肿瘤类型。有趣的是，两个独立的NB细胞系(SK-N-AS和IMR-32细胞系)也诱导巨噬细胞在LPS刺激后表达更高水平的ACACA和FADS2(图1D)。LPS刺激对其表达水平影响不大。这些结果表明，在肿瘤诱导的巨噬细胞中，FA合成在4小时和24小时时间点上调。LPS刺激24h后，FA合成是肿瘤诱导巨噬细胞最明显的转录特征。这个转录信号存在于TC诱导的巨噬细胞和NB诱导的巨噬细胞中。
为了进一步确定肿瘤诱导的巨噬细胞的特征，用流式细胞仪检测了巨噬细胞极化标志物MHC-II和CD86(M1相关)以及CD206、CD163和MerTK(M2相关)的细胞表面表达(图1E)。总体而言，表达水平很低，只有5%-40%的细胞呈阳性，这表明在这个相当早的时间点(48小时)，细胞群体具有广泛的异质性。细胞存活率在所有条件下均为80%-90%，由活性染料测定。有趣的是，M1标记MHC-II和CD86的表达不受肿瘤细胞存在的影响，而M2相关标记CD206、CD163和MerTK在TPC-1诱导和SK-N-AS诱导的巨噬细胞中均显著上调(图1E)。这些发现通过qPCR得到验证，表明M2相关标记在转录水平上的表达增加。这一模式在未刺激和LPS刺激条件下都存在，但在未刺激条件下最为显著。
2. 代谢组学分析：肿瘤诱导的巨噬细胞脂质代谢增强
为了验证转录组水平上发现的脂质代谢的变化，并能够全面和完整地分析肿瘤诱导的巨噬细胞的代谢变化，对TPC-1诱导的巨噬细胞进行了基于非靶向质谱的代谢组学测量，鉴定了1121个代谢物。将与transwell上层小室共培养的单核细胞作为对照组，共培养24小时后，用培养基或LPS刺激细胞24小时(参见图2A中的实验设置)。使用KEGG途径分析来计算富集，发现几个与脂质相关的途径和“糖酵解”途径是富集程度最高的途径(图2B)。虽然p值很低，但由于样本量相对有限(n=3)，这些数据证实了主要与脂质相关的代谢物的增加。基于所有代谢物的主成分分析(PCA)没有显示对照单核细胞与肿瘤诱导的巨噬细胞的明显分离(图2C)，而选择性地基于代谢组学数据集中检测到的所有脂质代谢物的主成分分析(PCA)确实显示了明显的分离(图2D)。这种脂质代谢物特征在非刺激(RPMI)条件下最为明显(图2e)，与LPS重新刺激的细胞相比，99种脂质显著富集，而在LPS刺激的细胞中，脂质的变化没有达到显著水平。有趣的是，TPC-1诱导的巨噬细胞中最高表达的脂质主要是磷脂，如磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)(图2e)。总之，这些数据证实脂质代谢是肿瘤诱导巨噬细胞受影响的关键代谢过程之一，重要的是，应该注意到代谢组分析只能作为更广泛的代谢物类别的指示，之后需要进一步的验证。
图2 TPC-1诱导的巨噬细胞代谢组学分析
TPC-1诱导的巨噬细胞在静息24小时(RPMI)和LPS刺激24小时(n=3)时的代谢产物相对于对照单核细胞的变化。(A)实验装置。(B)分析TPC-1诱导的巨噬细胞与对照单核细胞(NES)中富集的KEGG通路。(C)基于所有代谢物或(D)特定脂类代谢物的PCA图。(E)培养基(RPMI)刺激后TPC-1诱导的巨噬细胞的log2倍数变化和-log10调整p值的火山图。红色圆圈(p<0.05)显示脂质阳性富集。NES，归一化富集评分。
3. 脂质组学分析：肿瘤诱导的巨噬细胞中磷脂和鞘磷脂的富集
为了验证联合转录组和代谢组的发现，并能够确定哪些特定的脂质类别或种类在肿瘤诱导的巨噬细胞中特异性富集，进行了脂质组学研究。利用质谱对TPC-1诱导的巨噬细胞和对照单核细胞进行了具有较高覆盖率和特异性的专用脂质体分析(参见图2A中的实验设置)。脂质组学提供了几种脂类的分子脂类浓度和脂类的完整脂肪酸组成。发现TpC-1诱导的巨噬细胞的总脂含量比对照单核细胞高(图3A)，无论有没有内毒素刺激(内毒素刺激后p=0.0075)。脂类分析显示，SM(未刺激p=0.072)和磷脂类PE(未刺激p=0.014，LPS刺激p=0.015)浓度升高，PA(未刺激p=0.008，LPS刺激p=0.015)、溶血磷脂LPE(未刺激p=0.036，LPS刺激p=0.012)、LPC(未刺激p=0.062，LPS刺激p=0.011)和神经酰胺(Cer)(未刺激p=0.019，LPS刺激p=0.045)浓度降低(图3B)。有趣的是，链长和饱和度分析显示，LPS刺激后巨噬细胞脂质的FA链明显缩短(p=0.016)，TpC-1诱导的巨噬细胞有双键减少、饱和脂质增多的趋势(图3C)。
总之，脂质体分析证实了肿瘤诱导的巨噬细胞FA合成在转录水平上的上调，显示总脂含量增加，其中甘油磷脂和SM是主要贡献者。同时，这些脂质种类，如PA、溶血磷脂和神经酰胺的组成成分减少(图3D)。主要磷脂种类上调的观察结果与代谢组分析结果一致。
图3 TPC-1诱导的巨噬细胞的脂质组学分析
(A)TPC-1诱导的巨噬细胞在静息24小时和LPS刺激24小时后的相对脂质含量较高(P=0.0075)(n=4，两个独立实验)。(B)静息24小时(RPMI)和LPS刺激24小时(n=4，两个独立实验)后，TPC-1诱导和对照单核细胞中脂质类的相对含量。(C)TPC-1诱导的巨噬细胞和对照单核细胞在24小时静息(RPMI)或LPS刺激后的链长和饱和度(n=4供体，两个独立实验)。(D)脂质生物合成途径中上调(红色箭头)和下调(蓝色箭头)脂质的示意图。Car，肉碱；CE，胆固醇酯；Cer，神经酰胺；CL，心磷脂；DAG，二酰甘油；HexCer，己糖神经酰胺；LPC，溶血磷脂酰胆碱；LPE，溶血磷脂酰乙醇胺；PA，磷脂酸；PC，磷脂酰胆碱；PC-O，酯化磷脂酰胆碱；PE，磷脂酰乙醇胺；PE-O，酯化磷脂酰乙醇胺；PG，磷脂酰甘油；PI，磷脂酰肌醇；PS，磷脂酰丝氨酸；SM，鞘磷脂；TAG，三酰甘油胺；PE-O，酯化磷脂酰乙醇胺；PG，磷脂酰甘油；PI，磷脂酰肌醇；PS，磷脂酰丝氨酸；SM，鞘磷脂；TAG，三酰甘油胺；PE-O，酯化磷脂酰乙醇胺；PG，磷脂酰甘油；PI，磷脂酰肌醇；PS，磷脂酰丝氨酸；SM，鞘磷脂；TAG，三酰甘油。
4. 肿瘤诱导巨噬细胞脂质生物合成对其炎症表型的影响
在接下来的一系列实验中，作者开始阐明增强的FA生物合成的功能相关性。已知巨噬细胞的细胞代谢对其炎症功能至关重要，许多脂质类物质调节炎症。为了评价肿瘤诱导巨噬细胞的炎症功能，测定了巨噬细胞与TC(TPC-1和FTC-133)和NB(IMR-32和SK-N-AS)细胞共培养后细胞因子的产生。这些肿瘤细胞系在LPS刺激后，巨噬细胞产生的TNF-α、IL-6和IL-10均高于对照单核细胞(图4A)。已知一种由肿瘤细胞释放的炎症代谢物是乳酸，Warburg效应中糖酵解的最终产物。TC细胞系和NB细胞系都分泌乳酸，尽管NB细胞的分泌量略低(图4B)。与作者小组早先的研究结果一致，在共培养环境中阻断乳酸受体可显著降低肿瘤诱导的巨噬细胞、TC诱导的巨噬细胞和NB诱导的巨噬细胞的细胞因子反应(图4A)。
为探讨脂质生物合成在TC诱导的(TPC-1细胞系)巨噬细胞炎症功能中的作用，用特征良好的FASN抑制剂C75抑制脂质生物合成，并测定细胞因子的产生。在共培养环境中，抑制脂质生物合成显著降低了细胞外细胞因子TNF-α、IL-6和IL-10的水平(图4C，D，上图)。为了排除这些发现是由于抑制剂对肿瘤细胞的直接作用，而不是对巨噬细胞，分别抑制了单核细胞或肿瘤细胞的FA合成(分别见图4C中的实验设置，中图和下图)。来自未经处理的肿瘤细胞的条件培养液中添加该抑制剂也降低了肿瘤诱导的巨噬细胞中的细胞因子反应(图4D，中图)。相反，当将抑制剂单独加入到肿瘤细胞中，并在将单核细胞加入到共培养的下层隔室之前将其移除(图4C，下图)，没有观察到细胞因子水平的降低(图4D，下图)。这些结果表明，抑制巨噬细胞中的脂质生物合成，而不是肿瘤细胞中的脂质生物合成，会影响肿瘤诱导的巨噬细胞的细胞因子反应。有趣的是，阻断CD36介导的FA摄取并没有改变细胞因子反应。在测试的抑制剂浓度下，没有观察到单核细胞的细胞毒性或裂解。综上所述，这些结果表明巨噬细胞的脂质生物合成是细胞因子对LPS刺激反应的关键。
有趣的是，在转录水平上，肿瘤诱导的巨噬细胞中细胞因子的产生没有明显的上调(LPS刺激4小时后：TNF p=0.364，FC 1.149；IL 6 p=0.033，FC−8.799；IL 10 p=0.291，FC−1.121；LPS刺激24小时后：TNF p=0.987，FC−1.116；IL 6 p=0.991，FC−1.042；IL 10 p=0.305，FC−1.328)，但在肿瘤诱导的巨噬细胞中，囊泡的生物生成略有上调(图1B)。鉴定出的富集脂主要由磷脂组成，磷脂是膜的主要成分。总之，这些发现促使作者探讨肿瘤诱导的巨噬细胞中脂质生物合成的增强是否可能通过促进细胞因子的分泌而导致更高的细胞外细胞因子水平。因此，用Western blot检测TPC-1诱导的巨噬细胞和对照单核细胞在有或无Brefeldin A阻断细胞因子分泌的LPS刺激下的细胞内细胞因子水平。有趣的是，在LPS刺激4h后，TPC-1诱导的巨噬细胞内TNF-α水平高于对照单核细胞，包括阻断Brefeldin A的分泌(图5A)，表明TPC-1诱导的巨噬细胞细胞因子的产生增加。与先前的研究结果一致，在TPC-1诱导的巨噬细胞中，细胞外细胞因子水平显著升高(图5B)。在用Brefeldin A治疗时，不再观察到这些细胞外细胞因子水平的差异(图5B)，表明Brefeldin A治疗成功地阻断了细胞因子的分泌。结合Brefeldin A处理的细胞内细胞因子水平，这些数据表明，肿瘤诱导的巨噬细胞中较高的细胞外细胞因子水平很可能是由转录（后）变化引起的。
图4 肿瘤诱导巨噬细胞的细胞因子反应
(A)在24小时LPS刺激下，肿瘤诱导的巨噬细胞表现出较高的细胞外TNF-α、IL-6和IL-10水平(白条)。在共培养过程中抑制乳酸受体可降低细胞外细胞因子水平(黑条)(n=9，三个独立实验，双向方差分析，然后进行Bonferroni's后测)。(B)甲状腺癌(TPC-1和FTC-133)和神经母细胞瘤(SK-N-AS和IMR-32)细胞株24小时条件培养液中乳酸浓度(n=12，3个独立实验，单因素方差分析，然后进行Bonferroni多重比较试验)。(C)在共培养体系中区分药物抑制剂对肿瘤细胞和单核细胞(共培养)、单核细胞单独(条件培养基)和肿瘤细胞单独(抑制肿瘤细胞)的影响的实验装置。(D)在共培养期间用脂肪酸合成抑制剂(C75)处理，和在肿瘤条件培养基中培养期间，减少了24小时LPS刺激下的细胞因子反应。C75预处理肿瘤细胞不影响单核细胞的细胞因子反应。未受刺激的细胞不会产生可检测到的细胞因子水平。n=8，3个独立实验，双尾配对t检验。虚线表示较低的检测下限。方差分析；LPS，脂多糖。
图5 TPC-1诱导的巨噬细胞胞外细胞因子水平升高不是由细胞因子分泌增加引起的
单核细胞与TPC-1细胞或单核细胞在Transwell系统中共培养24h。去除传孔后，用LPS刺激肿瘤诱导的巨噬细胞4h。LPS作用1h，Brefeldin A阻断分泌。(A)用Western blot检测细胞内TNF-α和β-actin的水平。TNF-α的定量是相对于β-actin进行的。(B)采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定细胞外TNF-α水平(n=2)。脂多糖；TNF-α；肿瘤坏死因子α。
5. 肿瘤诱导的巨噬细胞脂质生物合成是提高活性氧产生能力所必需的
除了细胞因子，巨噬细胞产生的其他炎症介质是活性氧。活性氧被认为是强有力的DNA损伤剂，是甲状腺细胞中肿瘤的前驱事件，也被认为有助于在肿瘤发生的后续阶段维持基因组的不稳定性。此外，在NB中，ROS与更具侵袭性的肿瘤表型相关，因此作者研究了肿瘤诱导的巨噬细胞中ROS的产生是否增强。共培养后，收集肿瘤诱导的巨噬细胞和对照单核细胞，测定活性氧(ROS)的产生。为了诱导ROS的产生，细胞用ROS诱导剂PMA或优化酵母多糖处理1小时。在用ROS诱导剂处理时，TPC-1诱导的巨噬细胞表现出明显高于对照单核细胞的ROS水平，尽管确实观察到供体的变异，一些供体表现出低水平的ROS(图6a)。有趣的是，当脂质生物合成在共培养过程中被抑制时，TPC-1诱导的巨噬细胞和IMR-32诱导的巨噬细胞的ROS水平强烈降低到对照单核细胞的水平(图6B)。这些结果表明，脂质生物合成对于肿瘤诱导的巨噬细胞产生ROS的能力至关重要。
图6 肿瘤诱导的巨噬细胞产生活性氧
(A)在PMA或血浆优化酵母多糖刺激下，TPC-1诱导的巨噬细胞(TAMS，红色)比对照单核细胞(绿色)显示更高的ROS水平(两个独立的实验，n=5，测量为三个一组)。(B)在共培养(深色)期间使用脂肪酸合成抑制剂(C75)可降低TPC-1诱导的(红色)和IMR-32诱导的(蓝色)巨噬细胞中PMA或酵母多糖刺激的ROS水平(n=2-3；1-3个测量值)。PMA，巴豆醇12-肉豆蔻13-乙酸酯；ROS，活性氧；TAM，肿瘤相关巨噬细胞。
讨论
在这项研究中，首次证明了肿瘤诱导的巨噬细胞具有增强的脂质生物合成，导致更高的总脂含量和细胞内磷酸甘油和SM的富集水平。与对照单核细胞相比，肿瘤诱导的巨噬细胞在LPS刺激下产生更高水平的细胞外细胞因子。此外，在PMA或优化酵母多糖的刺激下，它们表现出更强的产生ROS的能力。抑制FA的合成可以逆转细胞因子反应和ROS产生这两个特征。这些数据表明，FA合成在肿瘤诱导的巨噬细胞的细胞因子和ROS反应中起重要作用(图7)。
图7 原理图摘要
可溶性肿瘤信号通过诱导糖酵解和脂肪酸生物合成改变巨噬细胞的代谢和功能特征，导致磷脂和鞘磷脂的富集。这些代谢特征有助于肿瘤诱导的巨噬细胞的细胞因子和ROS反应，这与瘤前的表型有关。DAG，二酰甘油酯；FA，脂肪酸；PC，磷脂酰胆碱；PE，磷脂酰乙醇胺；PI，磷脂酰肌醇；PS，磷脂酰丝氨酸；ROS，活性氧物种；SM，鞘磷脂。
代谢编程已被描述为TAMs的一个关键特征，在其表型和功能特征中发挥着重要作用。到目前为止，大多数研究都集中在糖酵解和OXPHOS作为免疫细胞和TAMs中的代谢读数。使用体外肿瘤诱导的巨噬细胞的间接共培养模型，本研究显示肿瘤诱导的巨噬细胞的糖酵解和OXPHOS增加。在这里，使用相同的模型，研究肿瘤细胞分泌体对单核细胞的影响，现在报告这些肿瘤诱导的巨噬细胞也有促进脂质生物合成的作用。通过整合转录组、代谢组和脂质组的数据，证明单核细胞在遇到肿瘤细胞的分泌因子时，其细胞内脂质代谢会发生复杂的变化。
巨噬细胞的代谢变化可以直接影响它们的免疫功能。虽然抑制糖酵解可以防止肿瘤诱导的巨噬细胞中的促炎反应，但人们对脂代谢改变的功能影响知之甚少。通过抑制FA的生物合成，发现脂质生物合成有助于肿瘤诱导的巨噬细胞的功能和表型特征。相反，抑制CD36介导的脂质摄取不会影响它们的功能特征，表明从头合成脂质功能的重要性。值得注意的是，CD36介导的脂质聚集在髓系来源的抑制细胞中已有报道。肿瘤诱导的巨噬细胞在LPS和TLR4刺激时，细胞外促炎细胞因子TNF-α和IL-6以及IL-10水平增加。FA的生物合成对于产生细胞因子的能力至关重要，因为抑制FA的生物合成会显著降低细胞外细胞因子的水平。
除细胞因子反应增强外，肿瘤诱导的巨噬细胞在PMA或优化酵母多糖刺激下产生ROS的能力比对照单核细胞高。活性氧水平升高是癌症进展和治疗抵抗的共同标志，ROS水平的上调可能导致氧化损伤，如DNA突变，从而导致癌症的发生和发展。在巨噬细胞中，ROS被认为是体外M2表型调节和体内TAMs发生的关键成分。在这里，证明了肿瘤诱导的巨噬细胞在刺激时产生ROS的能力更高，而这一能力通过干扰FA的合成而被强烈地抑制。因此，FA合成在肿瘤诱导的巨噬细胞产生ROS过程中起着至关重要的作用。
巨噬细胞的炎症表型已被证明是许多肿瘤的TAMs的特征。通过释放炎症介质，如ROS、TNF-α和IL-6，TAMS被认为介导了DNA损伤、致癌转化、炎症诱导的癌变和肿瘤的进展。TAMs产生的许多炎性细胞因子直接影响基质细胞的募集、肿瘤细胞的侵袭、生存和血管生成。由TAMS引起的癌症相关炎症被认为是癌症的标志之一。通过表达IL-10，TAMs有助于抑制获得性免疫，如细胞毒性T细胞反应。TAMs通常被认为具有M2样表型，然而基于转录组的新见解显示，二分法M1/M2巨噬细胞模型已经过时，因为巨噬细胞激活状态的谱更流畅。研究发现，肿瘤诱导的巨噬细胞增加了TNF-α和IL-6('M1样’)的产生，同时显示出CD206和CD163样细胞表面标记的表达增加，这突显了在体内也观察到的巨噬细胞极化的表型变化。
有趣的是，观察到肿瘤诱导的巨噬细胞中脂质含量增加，特别是甘油磷脂和SM。由于这些脂质是细胞膜脂质双层的关键成分，可以参与分泌途径，推测它们可能与肿瘤诱导的巨噬细胞分泌细胞因子有关。然而，发现刺激作用下的细胞外细胞因子水平可能不是由细胞因子的分泌引起的，而是由较高的细胞因子产生引起的。在受刺激的肿瘤诱导的巨噬细胞中，甘油磷脂和SM可能参与了信号转导而不是分泌途径，因为鞘脂代谢在刺激后改变了TLR4的运输和可能随后的信号转导。
与作者的发现一致，其他研究表明，在转录水平，抑制FASN可以降低了小鼠骨髓来源的巨噬细胞中IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-10的水平，这是对不同的TLR激动剂的反应。FASN是巨噬细胞活化过程中TLR信号的重要调节因子，FASN代谢产物乙酰乙酰辅酶A将FA生物合成与胆固醇生物合成联系起来，从而影响脂筏形成和TLR4信号转导。这些结果表明，FASN的上调可能解释了肿瘤诱导的巨噬细胞对LPS刺激的细胞因子反应增加的原因。FASN上调可能增加TLR4激动剂LPS诱导的脂质形成，从而增加TLR信号转导，导致更高的细胞因子应答。需要进一步的研究来证实在肿瘤诱导的巨噬细胞中脂质形成和TLR信号的增强。
巨噬细胞除了并入膜外，还可以向周围的介质分泌脂质分子，这些分子可以被其他细胞摄取。先前的研究表明，巨噬细胞将标记的胆固醇、脂肪酸和PC转移到培养中的淋巴细胞，从而抑制淋巴细胞的增殖。此外，研究表明，体内注射到血流中的标记脂质负载的巨噬细胞将标记的胆固醇和花生四烯酸转移到大鼠的组织中。巨噬细胞转移脂质的这一特性可能在肿瘤诱导的巨噬细胞的背景下，通过向肿瘤细胞提供用于膜形成和增殖的脂质来促进其促肿瘤功能，未来的研究将有必要对这一假说进行评估。
有趣的是，Ecker等人发现，在M-CSF诱导原代人单核细胞分化的过程中，磷脂的生物合成受到诱导，而胆固醇的生物合成受到损害。此外，他们还表明，在4天的巨噬细胞培养中，FA的生物合成是吞噬细胞分化所必需的。当观察到肿瘤诱导的巨噬细胞的磷脂生物合成增加时，人们可能会推测，肿瘤衍生因子可能通过上调磷脂的生物合成，同样地诱导巨噬细胞分化。
有趣的是，巨噬细胞从OXPHOS转变为糖酵解也可以显示出三羧酸(TCA)循环中间产物的积累，包括富马酸、苹果酸和琥珀酸。例如，柠檬酸可以被重定向用于FA的生物合成和磷脂的产生，还可以通过苹果酸酶和丙酮酸产生NADPH，这是ROS和NO产生所必需的。此外，琥珀酸的线粒体氧化被证明可以推动线粒体ROS的产生。正如在肿瘤诱导的巨噬细胞中看到的类似的代谢程序，显示糖酵解的增加和琥珀酸水平的增加，可能观察到更高的ROS水平，这是由于琥珀酸的线粒体氧化增加导致的。
总之，使用两种与高巨噬细胞浸润相关的肿瘤模型，即TC和NB，发现肿瘤诱导的巨噬细胞在遇到肿瘤细胞分泌的因子时，其细胞代谢会发生复杂的变化。脂质生物合成是肿瘤诱导的巨噬细胞的一个重要代谢特征，参与了几个促肿瘤功能特征，如细胞因子和活性氧的产生(图7)。这些发现可能对通过代谢编程在恶性肿瘤中针对巨噬细胞的新的治疗策略的开发具有重要意义。
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