《科学》子刊：二甲双胍又对一个新癌种下手了！
二甲双胍又对一个新癌种表现出了治疗潜力。
近日，来自密歇根大学的Sriram Venneti教授团队在《科学转化医学》杂志发表重磅研究成果[1]。
研究者发现：二甲双胍可以抑制肿瘤中因表观遗传学改变而出现的代谢亢进（糖酵解的三羧酸循环），并在体外实验及动物模型中均起到良好的抗后颅窝A型室管膜瘤（PFA）效果。由于二甲双胍已广泛应用于临床（安全性很好），该研究成果或将很快能够转化到临床应用。
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室管膜瘤起源于脑室的室管膜细胞，好发于后颅窝，在儿童后颅窝肿瘤中发病率（2.19～3.5/100万儿童）仅次于髓母细胞瘤和小脑星形细胞瘤，其中PFA的发病率及恶性程度最高，主要发生在平均年龄为3岁的儿童中，约40%不可治愈[2]。
目前，PFA的治疗以手术和放疗为主，尚无有效的治疗药物，尤其是三岁以下的婴幼儿因其无法耐受放疗，整体预后很差[3]。因此，寻找有效的治疗药物，对于PFA的治疗至关重要。
虽然PFA的发生机理仍不明确，但目前的证据表明，该类肿瘤的主要驱动因素是表观遗传学改变，而不是基因变异。
例如，PFA的全外显子组和全基因组测序显示，约4%的PFA具有弥漫中线胶质瘤中存在的H3K27M（组蛋白H3第27位赖氨酸被甲硫氨酸替换）突变，约9%的肿瘤存在EZHIP（也称为CATACOMB或CXorf67）突变，另外超过85%的PFAs不存在高频基因突变，而是出现野生型EZHIP（EZHIP-WT）过表达[4]。
已有研究表明，EZHIP可通过与H3K27-甲基转移酶EZH2结合，抑制PRC2复合物的功能从而降低H3K27me3；由于H3K27me3可抑制基因转录，因此H3K27me3被抑制后，它控制的基因表达则增加，最后达到了与H3K27M突变一样的效果[5]。
由于H3K27M突变可上调关键代谢途径（包括糖酵解和三羧酸循环），从而调控H3K27me3[6]，那么可模拟H3K27M突变效果的过表达EZHIP-WT，是否也在PFA中对肿瘤的代谢起到一定的影响呢？
研究人员首先利用先前已发表的3篇文献中的转录组测序数据，分析了PFA与后颅窝B型室管膜瘤（PFB预后良好，且不存在EZHIP过表达以及H3K27me3降低）的代谢相关基因表达差异，找到了53个在PFA中表达上调的基因，这53个基因主要与糖酵解、三羧酸循环、谷氨酸和戊糖磷酸途径（PPP）代谢相关，包括己糖激酶2（HK2）和丙酮酸脱氢酶B（PDHB）。
由于转录组测序反应的是肿瘤组织中所有细胞基因表达的平均水平，研究人员进一步使用已报道的单细胞测序数据，证实了HK2和PDHB等基因在PFA肿瘤细胞中表达上调。（图1）
图1 A.PFA与PFB临床特征差异 B.已报道的3个转录组测序数据中PFA相比于PFB表达均上调的基因有53个 C.53个基因通路影响分析显示与糖酵解、三羧酸循环、PPP代谢相关 D.糖酵解、三羧酸循环、PPP代谢途径中的关键酶，其中蓝色的表示在PFA中上调 E.单细胞测序数据验证HK2和PDHB在PFA肿瘤细胞中表达比PFB肿瘤细胞高
紧接着，研究人员通过质谱分析评估了三种后颅窝室管膜瘤亚型（PFA, PFB和ST-RELA）中代谢物的浓度，并使用正常的儿童小脑和皮质组织作为对照。结果显示：相比于PFB、ST-RELA和对照组，PFA中糖酵解、三羧酸循环和PPP相关的代谢物浓度升高（图2）。
图2 质谱分析显示PFA中糖酵解、三羧酸循环和PPP相关的代谢物浓度升高
研究人员还对15例室管膜瘤患儿进行了无创磁共振波谱成像（MRS），评估其体内代谢物浓度。根据患者肿瘤组织H3K27me3和EZHIP 的免疫染色的结果，将其分为PFA（n = 7, H3K27me3阴性，EZHIP阳性），PFB（n = 3，H3K27me3阳性，EZHIP阴性）和ST-RELA（n = 5，H3K27me3阳性，EZHIP阴性，C11orf95-RELA融合）。
检测结果显示：与PFB相比，PFA含有更高浓度的柠檬酸和谷氨酸；与ST-RELA相比，PFA含有更高浓度的肌醇、牛磺酸和肌酸。
这表明，PFA具有独特的MRS成像特征，且代谢相对活跃（图3）。
图3 A.三种后颅窝室管膜瘤亚型磁共振图像及H3K27me3和EZHIP 的免疫染色 B.三种后颅窝室管膜瘤亚型MRS图像 C.PFA相比于PFB以及ST-RELA代谢物浓度更高
以上实验证实了在PFA中，糖酵解以及三羧酸循环等代谢途径的确存在亢进的情况，研究人员试图探究EZHIP过表达如何导致代谢亢进。由于H3K27M突变是通过在表观遗传层面激活关键代谢基因，来增强糖酵解和三羧酸循环代谢，研究人员猜想EZHIP也是通过此途径起到作用。
研究人员首先观察了肿瘤组织中一些相关蛋白的表达情况，WB结果显示：与PFB相比，PFA中激活性组蛋白标志H3K27ac（组蛋白H3第27位赖氨酸乙酰化）增加。
接着，研究人员通过免疫组化评估了EZHIP、H3K27me3和H3K27ac在室管膜瘤中的表达关系，结果显示：EZHIP表达升高，与PFA中H3K27me3降低和H3K27ac升高相对应。
由于PFA在幼儿中更常见，研究人员还比较了这些标志物的表达与年龄的关系，发现10岁以下儿童EZHIP和H3K27ac高于10岁以上儿童，而H3K27me3则相反。（图4）
图4 A.免疫组化评估EZHIP、H3K27me3和H3K27ac在室管膜瘤中的表达关系 B. EZHIP、H3K27me3和H3K27ac与年龄的关系
为了进一步研究EZHIP对代谢的影响，研究人员构建了EZHIP-M406K室管膜瘤细胞系（NSCs）（EZHIP在第406位有蛋氨酸（M）残基，该残基对PRC2抑制至关重要，将该M替换为赖氨酸（K），这降低了EZHIP功能），以具有功能活性的EZHIP-M406I作为对照。
与EZHIP-M406K NSCs相比，EZHIP-WT和EZHIP-M406I中H3K27me3均降低，而H3K27ac均升高。与EZHIP-M406K NSCs相比，EZHIP-WT细胞的增殖增加。
这表明EZHIP能够使PFA中H3K27me3减少，同时使H3K27ac增加。（图5）
图5 A.EZHIP-WT、EZHIP-M406I、EZHIP-M406K中H3K27me3以及H3K27ac B.与EZHIP-M406K细胞相比，EZHIP-WT细胞的增殖增加
研究人员进一步在细胞系及不同肿瘤亚型中，鉴定出了由于H3K27ac增加而表达上调的基因。果不其然，HK2、PDHB、AMPKα2等糖酵解的关键基因赫然在列（图6）。
图6 在细胞系及不同肿瘤亚型中鉴定由于H3K27ac增加而表达上调的基因（HK2、PDHB、AMPKα2）
此时，研究人员注意到，AMPKα2作为代谢传感器AMPK的重要组分之一，在PFA中表达增加，这让他们想到了二甲双胍（其关键作用靶点之一就是AMPK），同时二甲双胍还有抑制TCA循环的作用，因此他们推测二甲双胍是一种治疗候选药物。
紧接着，研究人员便测试了不同细胞系对二甲双胍治疗的敏感性，结果显示：所有肿瘤细胞系都对二甲双胍敏感，但EZHIP-WT的细胞比EZHIP-M406K细胞更敏感。同时，体外实验也表明，二甲双胍可显著抑制肿瘤生长，延长荷瘤小鼠的生存期（图7）。
图7 体外实验验证二甲双胍治疗PFA的有效性
实验证实，二甲双胍可抑制TCA 以及PPP代谢，降低EZHIP的表达，是细胞H3K27me3增加，抑制AMPK的表达，从而起到抗肿瘤的作用。（图8）
图8 二甲双胍可抑制TCA 以及PPP代谢，降低EZHIP的表达，使细胞H3K27me3增加，抑制AMPK的表达
总的来说，研究人员证明了EZHIP可驱动PFA肿瘤中H3K27ac增加，进而使糖酵解和三羧酸循环代谢增强，促进肿瘤生长，而二甲双胍可以拮抗这一作用，有效抑制肿瘤生长。
虽然这一发现在转化为临床应用之前还需要更多的实验来进行评估，但这一发现将很有可能在未来应用于儿童PFA的治疗，改善患者的预后。
参考文献
1. P. Panwalkar, et al. Targeting integrated epigenetic and metabolic pathways in lethal childhood PFA ependymomas. Science Translational Medicine. 2021
2. K. W. Pajtler, et al. Molecular classification of ependymal tumors across all CNS compartments, histopathological grades, and age groups. Cancer Cel. 2015
3. T. E. Merchant. Current clinical challenges in childhood ependymoma: A focused review. Journal of Clinical Oncology. 2017
4. J. Bayliss, et al. Lowered H3K27me3 and DNA hypomethylation define poorly prognostic pediatric posterior fossa ependymomas. Science Translational Medicine. 2016
5. S. U. Jain, et al. H3K27M and EZHIP impede H3K27-methylation spreading by inhibiting allosterically stimulated PRC2. Molecular Cell. 2020
6. C. Chung, et al. Integrated metabolic and epigenomic reprograming by H3K27M mutations in diffuse intrinsic pontine gliomas. Cancer Cell. 2020
责任编辑丨BioTalker