科研 | Microbiome：南农崔中利、张瑞福等：粘细菌—驱动土壤菌群演替的“狼群”
编译：CC LabMe，编辑：小菌菌、江舜尧。
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捕食是构建生态系统群落结构和维持生物多样性的关键过程，是生物个体之间广泛存在的一种相互作用模式。微生物群落中的捕食涉及到原生生物、噬菌体以及具有捕食能力的细菌和真菌等。粘细菌是一类具有多细胞群体行为特征的通才型（Generalist predator）捕食性微生物类群，具有复杂的生活史，能够形成类似于真菌的多形态子实体结构，被认为是高等的原核生物。粘细菌对多种细菌和真菌的捕食作用，使其处于土壤微生物食物链的顶端。
为了验证粘细菌对植物真菌病害防治的效果及研究其捕食、运动行为在土壤微生物生态系统平衡中可能发挥的重要作用，研究人员以珊瑚球菌属粘细菌EGB为材料，利用农业废弃物进行固体发酵。研究人员首先验证了固体发酵基质在温室及田间对黄瓜枯萎病的防控效率，分析了固体发酵基质使用后，粘细菌EGB在土壤中的生态行为及其运动过程中对土壤微生物群落的调控作用；其次，通过粘细菌对黄瓜根际分泌物的响应及其在黄瓜根表的定殖分析揭示EGB向黄瓜根部迁移的驱动因素。本研究通过粘细菌-黄瓜-土壤微生物互作分析发现EGB对黄瓜根际分泌物中的麦芽糖和麦芽糖醇具有较强的趋化作用；在此驱动下，EGB向黄瓜根部迁移并定殖。研究成果揭示了粘细菌在土壤中向植物根部迁移的时空分布规律，提出并验证了粘细菌的捕食行为驱动了土壤中作物有益微生物群落结构稳定，从而降低病害发生的研究假设。该研究对于挖掘新型生防微生物资源具有重要的参考和指导意义。
论文ID
原名：Apredatory myxobacterium controls cucumber Fusarium wilt by regulating the soil microbial community
译名：捕食性粘细菌通过调控土壤微生物群落防控黄瓜枯萎病
期刊：Microbiome
IF：10.465
发表时间：2020.4
通信作者：崔中利教授&张瑞福教授
通信作者单位：南京农业大学生命科学学院
实验设计
研究内容
根据粘细菌液体培养易聚集和自溶的特点，研究者首先进行了EGB的固体发酵。为了验证EGB固体基质对黄瓜枯萎病的生防效果，研究人员分别进行了黄瓜温室盆栽实验和田间实验。盆栽实验结果表明：和尖孢镰刀菌黄瓜专化型（FOC）处理组相比，15天和27天时，EGB对枯萎病的防控率分别为67.4%和79.6%（Table 1）。27天后使用EGB固体生防基质处理组土壤中珊瑚球菌的数量稳定在5.56(Log10 copies g-1 soil)，而病原菌FOC的数量下降了1.4个数量级。同时，令人惊奇的是，和对照组相比，仅用FOC处理组土壤中珊瑚球菌的数量上升到了4.42(Log10 copies g-1 soil)。2015和2016年田间实验结果显示EGB固体基质对黄瓜枯萎病的生防率分别为66.0%和53.9%。综上所述，无论在盆栽实验还是在田间实验条件下，EGB均表现出对枯萎病优异的防控效果。
得益于粘细菌独特的运动系统（A运动和S运动），其能够在固体表面进行滑行运动；同时，和其它微生物相比，粘细菌降低了其在固体表面运动时对水分的依赖程度。为了验证EGB在土壤中的迁移行为，研究人员在盆栽实验中对土壤按照如下方式进行取样（Fig.1a）：I点为EGB固体基质施入点，R点为黄瓜种植点，M点为EGB基质到黄瓜根部中点。研究者分别于15天和27天在M点和R点进行土壤取样，通过16s rRNA扩增子测序及结合qPCR检测M点和R点土壤样品中珊瑚球菌属丰度。结果显示和对照组及FOC处理组相比，EGB固体基质处理组中珊瑚球菌的丰度呈现出时空规律变化，即15天时EGB和EGBFOC处理组中点土壤样品珊瑚球菌属丰度显著上升，此时R点土壤样品中珊瑚球菌属丰度并没有显著性变化，而27天后R点土壤样品中珊瑚球菌属丰度明显高于对照组和FOC处理组（Fig.1b）。该结果结合27天时根际土壤样品中珊瑚球菌荧光定量结果(Table 1)表明EGB从施入点向黄瓜根部发生了迁移行为。
Fig.1 土壤取样示意图（a）及各取样点土壤样品中珊瑚球菌属(b)和镰刀菌属(c)相对丰度变化
2 粘细菌EGB对黄瓜根际分泌物的趋化响应及其在黄瓜根部定殖
根据上述实验结果研究人员推测EGB在土壤中从施入点向黄瓜根部发生了迁移，那么是什么原因驱动了EGB向黄瓜根部迁移呢？研究人员首先分析了EGB对黄瓜根系分泌物的趋化性，结果表明EGB对黄瓜根际分泌物有明显的趋化作用（Fig. 2c）。实验进一步分析发现EGB对根际分泌物中的6种化合物具有趋化作用，其中对10-100 μM的麦芽糖和10-80 μM的麦芽糖醇的趋化作用最强（Table 2）。
Fig.2 EGB对黄瓜根际分泌物的趋化作用。a, EGB对化学物质的趋化示意图；b，EGB趋化实验的可行性分析；c, EGB对黄瓜根际分泌物的趋化测试
盆栽实验结果显示27天后，EGB处理组黄瓜根围土壤样品中EGB的数量能够维持在4.42(Log10 copies g-1 soil)以上，那么，EGB能否在黄瓜根际定殖成为决定其防控效果的关键。研究人员利用水培系统，同时用在黄瓜根际没有定殖能力的大肠杆菌做对照，结果显示EGB在黄瓜根表具有优异的定殖能力，其在伸长区的定殖能力强于分生区。
3 EGB对土壤微生物群落的调控分析
通过对各处理组不同时间不同取样点土壤样品高通量测序结果分析发现，和对照组相比，EGB固体基质处理15天时中点（M）土壤样品微生物群落的α多样性指数显著性下降，27天时恢复稳定水平。α多样性指数的变化与EGB的迁移过程相吻合，该结果表明土壤样品中微生物多样性的变化可能与EGB的迁移有关（Additional file 6:Fig. S4B和S4C）。对所有样品进行分析后发现，EGB处理是除黄瓜根际分泌物（PC1,43.1%）外造成土壤样品中微生物群落结构差异的主要原因（PC2,21.8%）表明EGB是细菌群落演替的重要驱动因素。
此外，研究人员分析发现EGB处理能够显著增加细菌群落结构复杂性,增强微生物之间的互作（Table 3）。EGB和FOC使用后，无论是从时间点（15天，27天）还是取样点（M，R）上，细菌群落被分成两个由负相关性属相连接的group（Fig.3）。有17个潜在的捕食性细菌属在细菌群落中被发现，其中8个属为粘细菌（Additional file12: Table S5），其中Corallococcus, Nannocystis,Flavobacterium, Stenotrophomonas, Cupriavidus, Lysobacter和Microvirga的相对丰度在EGB固体基质使用后显著性增加（p <0.05, Additional file 14: Table S7）。部分捕食性细菌作为网络结构中的hubs或者indicators出现，表明了捕食性细菌在调控土壤细菌群落中的潜在重要性。
Fig.3 不同土壤样品细菌群落的共发生网络分析（Spearman |ρ| >0.7 and p < 0.001）
讨论
文章从田间实验和盆栽实验中粘细菌对黄瓜枯萎病的实际生防效果出发，证明了捕食性粘细菌具备成为优秀生防微生物的潜力。尽管已有粘细菌用于辣椒炭疽病和盆栽树苗根部疾病防控的相关报道，然而，尚未进行田间实验验证生防效果。在本研究中EGB固体基质能够显著性降低黄瓜枯萎病的发病率，27天后EGB处理组FOC绝对丰度下降1.1-1.6个数量级，且黄瓜根际土壤中EGB的数量稳定在105–106copies g–1 土壤。相关文献也表明105–106copies g–1土壤是生防微生物发挥其生防效果的最低丰度。
能够在植物根际有效定殖是PGPR（plant growth-promoting rhizobacteria）类微生物防控植物病原菌的关键因素。例如，研究表明荧光假单胞菌CHA0生物膜的形成能够显著增强其在胡萝卜根表的定殖能力，且促进其和根际微生物之间稳定的相互作用。在本研究中粘细菌EGB能够稳定定殖于黄瓜根部伸长区，形成类似生物膜的结构，这得益于粘细菌庞大的基因组能够产生丰富的次级代谢产物和胞外多糖，丰富的胞外多糖能够促进粘细菌生物膜形成和植物根部的定殖。
此外，细菌在土壤中的运动能够强烈影响其在植物根际的定殖效率、微生物适应性和其生防效果。研究表明细菌运动是由鞭毛以趋化或集群运动（swarmingmotility）来驱动，完整的趋化和集群运动机制对PGPR到达并定殖于植物根际是十分重要的。如，研究表明高运动突变株荧光假单胞菌F113能够显著改善其在苜蓿根表的定殖，提高其生防效果。集群运动在芽孢杆菌在植物根际定殖中起着重要作用，然而，由鞭毛驱动的细菌运动仅限于湿润土壤中。尽管粘细菌缺少鞭毛，但其独特的运动系统（A运动和S运动系统）能够赋予其在固体表面滑行运动的能力。这种由粘附复合物驱动的滑行运动能够让粘细菌细胞在相对干燥和坚硬的土壤基质上滑行。本研究中粘细菌EGB从接种点到黄瓜根部8 cm的土壤距离上的规律的时空分布充分证明了粘细菌在相对干燥的土壤基质上运动的真实性。我们推测EGB对黄瓜根际分泌物的趋化作用同样是EGB向黄瓜根部迁移的驱动力。实验分析发现EGB对黄瓜根系分泌物种的麦芽糖和麦芽糖醇具有较强的趋化作用，最低趋化浓度为10 μM。文献报道表明麦芽糖是黄瓜和其它多种植物根系分泌物中重要成分，因此，我们猜测EGB可能对多种植物的根系分泌物具有趋化能力。
根际微生物对植物生长、营养和健康都很重要，如，抑病土为抵御土传病原菌的感染从而保护植物健康提供了最好的例子。研究表明抑病土能够通过长期单一栽培和有机改良诱导形成。抑病土往往有其独特的微生物群落结构，这些特有的微生物群落在抑制土传病害的发生上起着重要作用。如，从抑病土中分离出的假单胞菌和链霉菌被证明能够产生抗生素从而抑制土豆立枯和草莓枯萎病的发生。然而，许多从抑病土中分离的微生物由于与当地土著微生物的竞争作用，未能在土壤或植物根系中存活或定殖，因此，拮抗微生物的引入只是短暂或轻微的改变植物根际的微生物组极大的限制了拮抗菌在大规模农业生产中的应用。作为捕食性细菌，粘细菌EGB被证明能够捕食包括真菌和细菌在内的多种微生物。EGB使用后，土壤细菌多样性随时间和取样点的动态变化及细菌群落结构复杂性的显著提升表明EGB驱动了土壤中微生物群落的演替。高度连接的根际微生物群落结构也被证明能够显著降低病原菌对植物的入侵。此外，与珊瑚球菌属成正相关关系的潜在有益微生物，如Bacillus, Pseudomonas,Azotobacter和 Lysobacter等，相对丰度的上升可能有助于防止黄瓜植株被真菌感染，但也需要实验进一步证明（Additionalfile 11: Table S4；Additionalfile 13: Table S6）。
总结：根际微生物在植物抵御土传病原菌入侵中的重要性已被广泛认识，然而捕食性微生物在植病的生物防治中受到的关注较少。本研究中捕食性粘细菌，珊瑚球菌属EGB在田间实验中对枯萎病显示出较强的生物防治作用。我们的研究结果表明EGB菌株通过捕食作用改变了土壤微生物群落结构，降低了土壤中FOC的丰度。考虑到菌株EGB的捕食特性及其对土壤环境的良好适应，菌株EGB作为一种新型的枯萎病生物防治菌剂具有很大的商业开发潜力。同时，本研究基于捕食性粘细菌-植物-土壤微生物互作的研究模式，为其它具有生防潜力的捕食性细菌的挖掘与寻找提供了思路。
评论
小心的选择。我们的研究已经确定了一组具有这种功能较好的土壤细菌；下一步将从遗传和化学上鉴定抑制病原体和促进铁载体的细菌。微生物群所有成员产生的铁载体的类型可以形成一个数据库，任何病原菌的铁载体类型都可以对照该数据库进行绘制，以识别具有不相容的铁载体的微生物群落的特定成员。我们认为，这种铁载体错配分析可以作为微生物群介导的病原体管理的预测工具。这种方法在包括将病原体抗药性进化风险降至最低方面将会表现出重要的作用。在这种情况下，通过分泌一组化学上不同的铁载体，促进在多条战线上抗击病原体的不同根际群落是十分重要的。
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