AKTA蛋白纯化质粒pDNA提取(大通量，更适用于生产）
BIA Separations超螺旋 pDNA 生产（上海精瑞科学）
BIA Separations CIM® 整体柱涵盖了pDNA生产的研发、分析和生产规模的全过 程，可提供完美解决方案。您可以生产高纯度的超螺旋（sc） 形式的pDNA，并通过对生产过程中不同步骤的实时在线监测 来确保批次间的高重复性。此外，CIM®整体柱的高动态结合 能力（高达9 mg / mL）和高流速可达到传统色谱方法无法比 拟的高生产率。与传统方法相比，CIM®整体柱以更低的成本 提高生产效率，更适合满足提高基因治疗产品纯度的要求。 灵活性是我们在流程中构建的关键要素。 DEAE和C4 HLD色谱 柱可用于实验室到生产，但DEAE色谱柱可单独用于实验室规 模或纯度要求较低时使用。 也可使用CIMac™pDNA分析色谱柱。
CIMmultus™ HiP² Plasmid Process Pack™ 生产 ( 可在3.5 h内完成）
整个过程的结果表明，处理时间极短（33 minutes/mg pDNA），产率超过80％，sc pDNA的纯度超过FDA / EMEA要求
接下来为大家隆重介绍 BIA Separations 提供的，基于对流相互作用介质（CIM）层析整体柱的两步质粒 DNA（pDNA）纯化平台！
该方法除了具有以上全部优点，并且可以明显降低纯化时间，提高生产效率，使其成为 GMP 环境下的大规模 pDNA 纯化的选择。
该方法专为纯化大分子和纳米颗粒的整体柱而设计，可实现快速操作，高流量，同时提供动态结合能力和分辨率。
首先要为整个过程中的核心——两步层析步骤，准备细菌培养液
1. 大肠杆菌收获、裂解－碱裂解：
这是快速高效纯化质粒 DNA 亚型的基础。
操作建议：
先收集菌体；
然后采用碱性裂解法制备原料；
再将细菌细胞（通常是细胞生物质或细胞沉淀）悬浮在 50 mMTris-HCl，10 mM EDTA，pH8.0 中；
通过加入等体积的 0.1-0.4M NaOH，1%SDS 进行裂解。
2. 裂解液浓缩：
氯化钙沉淀后澄清，除去了大量的主要样品杂质
裂解后，悬浮液变粘稠，通过加入与悬浮缓冲液等体积的，4-8℃ 冷却的 3M CH 3 COOK（pH 5.5）沉淀细胞碎片和 SDS 复合物。
在温和混合下，缓慢加入 CaCl2 并孵育 15 分钟。
TIPS:
1. 氯化钙用作沉淀剂，以去除 RNA、基因组 DNA 和其他杂质;
2. 较高浓度的杂质需要 CaCl2 浓度高达 1M;
3. 考虑测试多种浓度并评估产品中杂质的有效去除和未受影响的 pDNA 产量;
4. 加入速度应该很慢，以防止局部温度上升;
5. 孵育后，进行一系列澄清步骤，从离心或粗过滤开始，例如 80μm 深度过滤，并以 1-5μm 过滤结束。
（低温有利于沉淀，混合过程应该温和操作，以防止 DNA 降解。）
前面 blabla 说了那么多，然而纯化才是本工艺的精华所在。
BIA Separations 的二步纯化工艺的稳健性、连贯性、时效性，均堪称教科书式的经典。
第一步纯化的柱子，通过弱阴离子交换，浓缩 pDNA 并去除大部分 HCP、mRNA 和基因组 DNA；
第二步利用疏水相互作用色谱（HIC）的抛光步骤，进一步从超螺旋（SC）治疗级 pDNA 中除去开环（OC）和线性 pDNA 亚型。
两步纯化的作用功能明确、互相合作，大大节省操作步骤和时间。
AEX 色谱柱（CIMmultus™DEAE）浓缩 pDNA，并去除大部分 HCP、mRNA 和基因组 DNA。
在弱阴离子交换柱上捕获质粒 DNA，其中除去剩余的 RNA 和蛋白质，样品结合需要低电导率，通过稀释实现。
随着增加 NaCl 的梯度洗脱，首先洗脱 RNA，然后洗脱质粒 DNA。
层析条件
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Monolithic column: |
CIMmultus™ DEAE(2 µm)*1 |
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Mobile phase: |
Equilibration buffer A1: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 7.2 |
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Washing buffer A2: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 0.6 M NaCl, pH 7.2 |
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Elution buffer A3: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, pH 7.2 |
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Working flow rates: |
0.5 – 5 column volume (CV) /min (具体取决于样品特性，使用的层析设备和色谱柱尺寸) |
*1 选择色谱柱体积，取决于需要处理的样品量。
层析方法
1. 用去离子水稀释细菌裂解物至电导率为 35-40mS / cm。稀释取决于样品制备过程中添加的 CaCl2 浓度。
2. 将稀释的样品用 0.45μm 过滤器进行过滤。
3. 将 20CV 的缓冲液 A1 平衡 DEAE 柱。
4. 将澄清的稀释细菌裂解液进行上样。
5. 用 20 CV 的缓冲液 A1 对色谱柱进行流洗。
6. 用 20 CV 的缓冲液 A2 对色谱柱进行流洗。
7. 用 20 CV 的缓冲液 A3（以半工作流速）洗脱并收集 pDNA。
图 1：AEX CIMmultus™DEAE（2μm）柱上的质粒 DNA 洗脱曲线
在高配体密度丁基修饰的（CIMmultus TM C4 HLD）整体柱上，利用疏水相互作用色谱柱（HIC）的抛光步骤，进一步从 超螺旋（SC）治疗级 pDNA 中除去开环（OC）和线性 pDNA 亚型。
为了富集质粒 DNA 的超螺旋亚型，将 DEAE 洗脱液上样到高配体密度丁基柱（C4 HLD）上。
该步骤进一步去除了杂质。
层析条件
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Monolithic column: |
CIMmultus™ C4 HLD (2 µm)*2 |
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Mobile phase: |
Equilibration buffer B0: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 3 M (NH4)2SO4, pH 7.2 |
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Washing buffer B1: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 1.7 M (NH4)2SO4, pH 7.2 |
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Adjustment buffer: 4 M (NH4)2SO4 |
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Elution buffer B2: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 0.4 M (NH4)2SO4 , pH 7.2 |
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Regeneration buffer A1: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 7.2 |
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Working flow rates: |
0.5 – 5 CV/min (具体取决于样品特性、使用的层析设备和色谱柱尺寸) |
*2 选择色谱柱体积，取决于需要处理的样品量。
层析方法
1. 调节来自 DEAE 柱的含 pDNA 洗脱液，每 1 体积（V）洗脱液加入 3 体积（V）的 4M(NH4)2SO4。
2. 用 20CV 的缓冲液 B0 来平衡 C4 HLD 柱。
3. 将 DEAE 柱洗脱的 pDNA 组份上样。
4. 用 20 CV 的缓冲液 B1 流洗色谱柱。
5. 用缓冲液 B2（以半工作流速）洗脱并收集 pDNA。
6. 用 30 CV 的缓冲液 A1 再生色谱柱。
7. 加样 3 次后，对柱子进行清洗。
图 2：在 HIC CIMmultus TM C4 HLD（2μm）柱上分离超螺旋质粒 DNA
· 从 C4 HLD 柱洗脱的超螺旋 pDNA 组份含有硫酸铵，必须在生物应用质粒之前将其除去。
· 缓冲液交换可通过透析滤过或体积排除色谱等方法进行。
· 配置和填充可能需要额外的处理。
二步法层析过程分析：
质粒 DNA 制造成功的关键是实时过程控制方法，确保最终产品中高百分比的超螺旋 pDNA。
CIMac™pDNA 分析柱可用于监测降解产物（开环和线性 pDNA），去除杂质（RNA），并确保每个生产步骤都能产生预期的超螺旋 pDNA 量。
CIMac™pDNA 分析柱还用于超螺旋质粒 DNA 含量的质量控制。
图 3：使用 CIMac™pDNA-0.3 分析柱的质粒 DNA 亚型含量的质量控制
点评
目前市面上有不少质粒纯化工艺方案，但是比较下来，BIA 二步法纯化工艺具有两大优势：
效率明显提高
只需两步色谱和高流速的整体柱色谱方案，减少工艺步骤（提高回收率）并加快纯化速度，从而显著提高生产率。
灵活放大
由于特定的整体柱设计，质粒 DNA 过程可以快速扩展到更大的单位。
在 1 毫升色谱柱上设计的工艺可以轻松转移到试验和生产规模。
在 8L 色谱柱上单次运行可以产生 48 g 药物级 scDNA。
Table 2: Scale up options.
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Column size |
pDNA purified per cycle |
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1 mL |
6 mg |
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8 mL |
48 mg |
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80 mL |
480 mg |
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800 ml |
4.8 g |
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8000 mL |
48 g |
十多年来，BIA Separations 一直是高效率质粒纯化的好选择。它不仅提供整体柱和平台模板，还提供定制的纯化服务，以完全满足您的质粒 DNA 纯化需求。