基因敲除细胞系(株)构建技术原理及优点

CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是新出现的一种由sgRNA指导Cas核酸内切酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。CRISPR/Cas9系统广泛存在于原核生物基因中，是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的一种适应性免疫防御机制。在这些生物体中，来自噬菌体的外源遗传物质获得和整合入CRISPR位点。这些序列特异的片段被转录成短CRISPR的RNA（CRISPR-derivedRNA），crRNA通过碱基配对与tracrRNA（trans-activating RNA）结合形成双链RNA，然后tracrRNA/crRNA复合体指导Cas9蛋白切断双链DNA。

利用CRISPR/Cas9技术能够进行目的基因敲除细胞系的构建（赛业可提供敲除细胞系构建服务）。该技术通过RNA指导Cas9核酸酶对靶向基因进行特定DNA编辑。CRISPR-Cas9系统的基因编辑效率更高，Cas9系统的载体构建与使用也更加便捷，随着CRISPR/Cas9技术的不断发展，该技术已广泛应用在各物种中，是目前普遍使用的基因编辑技术。

CRISPR/Cas9基因敲除细胞系技术实验原理：

CRISPR-Cas9技术的工作原理是：在II型CRISPR系统中，CRISPR RNA（crRNA）通过碱基配对与转录激活crRNA（Trans-activating crRNA, tracrRNA）退火形成能够特异识别基因组序列的复合体，然后通过PAM（5’-NGG-3’）序列结合并侵入DNA，引导Cas9核酸内切酶在目的片段生成DNA双链断裂（double-strand breaks, DSBs）。 这个识别复合体可以通过融合crRNA与tracrRNA序列形成sgRNA（single-guided RNA）进行简化。融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力，但由于结构得到了简化，更方便研究者使用。通过将表达sgRNA的元件与表达Cas9的元件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作。

CRISPR/Cas9基因敲除细胞系技术优点：

·具有编辑效率高、构建简单、操作方便等优点

·使用更加严苛的筛选标准，可以更有效地去除假阳性

·能够成本低廉地实现高效灵活的基因敲除

·具有广谱性，无基因、细胞及物种限制

·可实现多个靶位点同时进行基因打靶

·功能丰富，可实现敲除、插入、抑制、激活等多种目的基因

图1：CRISPR/Cas9介导的基因组编辑原理图

CRISPR/Cas9基因敲除细胞系构建流程：