科研 | Nature子刊: 海洋表面浮霉菌门和变形菌门中含有丰富的固氮种群
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海洋表面中的固氮影响全球海洋氮的生物利用度，从而影响微生物的初级生产力。到目前为止，蓝藻种群一直被视为生物可利用氮的主要供应者。虽然针对固氮酶还原酶基因的PCR扩增子调查显示存在多种非蓝细菌重氮营养群体，随后的定量PCR调查表明它们通常以低丰度存在。在这里，我们使用最先进的宏基因组装配和分级策略，从TARA(1)海洋宏基因组中回收近千个非冗余微生物群体基因组。其中，我们为栖息在开阔海洋表层水中的非蓝藻固氮营养物提供了第一个基因组证据，这些证据对应于变形菌门内的谱系，最引人注门的是浮霉菌门。后一种门的成员在水生系统中很普遍，但以前从未与固氮有关。此外，使用全基因组定量读数，我们证明发现的固氮生物不仅广泛，而且在太平洋和西北大西洋都非常丰富（单个群体的宏基因组读数高达0.3％）。我们的研究结果是延续了数十年的基于PCR的基因调查，并证实了异养细菌在地表海洋中固氮的重要性。
论文ID
原名：Nitrogen-fixing populations of Planctomycetes and Proteobacteria are abundant in surface ocean metagenomes
译名：宏基因组学表明海洋表面浮霉菌门和变形菌门中的固氮种群是丰富的
期刊：Nature Microbiology
IF：14.174
发表时间：2018年
通信作者：Tom O. Delmont 和A. Murat Eren
通信作者单位：美国芝加哥大学
实验内容
1 浮霉菌门和变形菌门固氮的基因组证据
我们鉴定了七种变形菌门和两种浮霉菌门的宏基因组装配(MAGs)，其中含有完整的固氮基因。据我们所知，这些宏基因组装配（MAG）（HBD-1至HBD-9）代表了栖息在开阔海洋表面的假定异养固氮菌（HBD）的第一个基因组证据。分别为脱硫弧菌门（HBD-01）；脱硫杆菌门（HBD-02），海洋螺菌门（HBD-03，HBD-04，HBD-05）和假单胞菌门（HBD-06，HBD-07），浮霉菌门（HBD-08，HBD-09）(表1)。
我们使用一组含有37个标记基因的家族将9个异养固氮菌(HBDs)放入432个变形菌和43个浮霉菌宏基因组装配(MAGs)的基因组的系统发育分析中（图1a）。两个Δ-变形菌里的异养固氮菌彼此密切相关，但在系统发育树中不相邻。海洋螺菌门(Oceanospirillales)细菌（n = 3），假单胞菌门( Pseudomonadales )（n = 2）和浮霉菌门( Planctomycetes )（n = 2）内的异养固氮菌形成三种不同的系统发育谱系。这些结果表明，紧密相关的固氮菌群体栖息在海洋表面，并且固氮基因偶尔出现在多种异养海洋微生物谱系中，与先前的研究一致。
平均而言，未知功能的基因比例对于变形菌HBDs为27.6％（±2.63％），对于浮霉菌门HBDs为49.3％（±0.5％），这反映了我们对固氮菌的后一分类群的功能性理解的缺乏。在9个HBD中鉴定的37,582个总基因编码了5,912个已知功能，并且基于已知功能的HBD网络分析将它们对应于Δ-变形菌，海洋螺菌，假单胞菌和浮霉菌的四个不同组（图1b），反映了我们的系统发育学分析。这些HBD中确定的大量功能（5,912中有4,224个）是四组之一所独有的（图1b）。这些组之间已知功能的相对较弱的重叠表明了在海洋中固氮的能力的组群可能与严格定义的功能生活方式无关。我们表征的HBD似乎涉及氮循环的不同步骤（例如，HBD-06的反硝化作用），并且具有调节固氮的不同策略，但与节能，运动，营养获取和基因调控过程有关的有共同特征。运动性，以前被认为是寻找有利于固氮的厌氧细胞的潜在机制，这是我们在所有HBD中观察到的一种常见特征，可能表明颗粒附着的生活方式，而不是在一些蓝藻固氮菌中观察到的共生生活方式。
图1：系统发育与HBD功能之间的关系。A：使用37个系统发育标记基因家族的集合，在非冗余基因组数据库（包括9个HBD）中对432个变形菌MAG和43个浮霉菌MAG进行系统发育分析。围绕系统发育树的层指示每个MAG在门和类水平上的基因组大小和分类。B：九种HBD的功能网络基于总共5,912种已鉴定的基因功能。基因组节点的大小和颜色分别代表检测到的功能和MAG分类的数量。功能节点的颜色表明它们出现在不同的HBD中。
2 HBD的分类与固氮基因的系统发育相一致
我们对来自各种固氮菌的催化nifH和nifD基因的系统发育分析，将我们的HBD分为四个不同的谱系（图2）。此分析还包括从非冗余基因组集合中移除的基因组重复。这些重复序列与它们在系统发育树中的代表性MAG聚类，在地理上遥远的HBD中揭示了几乎相同的固氮基因。HBD-01（脱硫弧菌）和HBD-02（脱硫杆菌）与密切的分类学亲属聚类。此外，γ-蛋白细菌HBDs与来自同一类别的假单胞菌属和固氮菌属的基因组最密切相关。最后，我们在浮霉菌门HBDs中鉴定的nifD和nifH基因形成了不同的簇，这对于nifD来说特别明显（图2）。用于固氮的所有催化和生物合成基因位于浮霉菌门HBD-09基因组中的单个操纵子中（HBD-8过于片段化而难以确定其组织）。HBD分类学与它们在基于功能基因的系统发育中的位置之间的一致性，以及与固氮有关的基因的同线性，都有利于这些基因在地表海洋中垂直的传播。
图2；固氮基因的系统发育。a，b：nifD（a）和nifH（b）的系统发生分析发生在15个固氮MAGs（包括5个冗余的MAGs）中，我们分别从TARA Oceans中鉴定出252和316个参考蛋白。MAG基于其在门的水平上的系统发育关系而着色
3 HBDS不仅是多样的，同时在海洋表面是丰富的
浮霉菌门和变形菌门的累积相对丰度在分别为0.01％和0.05％。厚壁菌门和浮霉菌门HBDS的相对丰度在地中海和红海（平均0.00064％）非常低。与此相反，相比于其他区域的宏基因组（图3），其是在太平洋富集的（平均0.14％）。事实上，太平洋宏基因组占据在整个数据集的宏基因组HBD的81.4％。两个最丰富的变形菌门和浮霉菌门HBDS（HBD-06和HBD-09）显示出广泛的分布（图3）和在该海洋（P <0.005）的显著富集。HBD-06也是富集在大西洋的西北地区，并在较小程度上富集在南大洋，示了单个群体的生态位可以包含多种海洋和宽的温度范围。有趣的是，HBD-07和HBD-08，其与HBD-06和HBD-09在系统发育和功能密切相关的，分别呈不仅较不丰富的，也表现出不同的地域分布（参见图3）。
图3：浮霉菌门和变形菌门的固氮种群丰度。上面：盒形图显示对应于12个海洋地理区域的浮霉菌门（N =2）和变形菌门（N =7）93个HBDS宏基因组的平方根归一化的累积相对分布。底部：地图显示HBD-06，HBD-07，HBD-08和HBD-09在四个海洋的表面上的适当位置的分区。
4 重建的nifH基因比在海洋表面宏基因组之前表征的nifH基因更丰富
我们基于与所述HBD数据库氨基酸相似性搜索九个附加非冗余nifH基因（图4）。这些nifH基因的系统发育分析它们属于迷踪菌门（N= 2），厚壁菌门（N = 2），变形菌门（N= 1），螺旋菌门（N= 1），疣微菌门（N = 1），一组未知的细菌（N = 1），和古菌门（N= 1）。九个HBD短宏基因组的平均核苷酸同一性读取的每个nifH基因介于97.4％和100％之间，这表明这些nifH基因序列对应的高度均匀的种系型。尽管他们高丰度在海洋表面上，并考虑到种系型保持环境中的这些微妙的变化，即使他们在海洋表面没有大规模调查。我们在广泛使用的引物序列的分析发现不匹配nifH这些基因，这是这种差异可能的原因。nifH基因读取数表明，在海洋表面丰富的HBDS可能不限于浮霉菌门和变形菌门（图4）。
图4 TARA海洋的背景下nifH基因相对丰度的参考集合和扩增。小提琴图总结本研究中检索到的nifH基因覆盖的平均均值，来自TARA海洋宏基因组大规模调查nifH参考数据库和nifH扩增子序列读取。在这项研究中检索到的18个nifH基因分成两组，并与nifH基因的序列的数据库对比。
结 论
本研究中描述的九种异养固氮菌（HBD）代表了与蓝藻无关的海洋表层固氮种群的第一个基因组见解，以及通过全基因组读取的高分辨率生态位分区。这些HBD包括两个浮霉菌门种群，这是该门中第一次观察到固氮生物型。从太平洋分析的海水样品使用宏基因组引导的ddPCR证实了浮霉菌门nifH基因的存在。这些发现补充了数十年的PCR扩增子调查，并且证实了宏基因组装配和分级策略的相关性，以提高我们对居住在地球上最大的生物群系的微生物群落的理解。
评 论
研究表明，浮霉菌门和变形菌门内的HBDs群体，以及其他古菌和细菌门中的假定的固氮菌群，在地表海洋中可能是丰富的，偶尔跨越广泛的生态位，跨越很大的温度范围。研究利用前所未有的宏基因组测序数据来研究没有引物偏好nifH基因的多样性。虽然这些结果证实关于HBDS在海洋表面的多样性，他们也证明了扩增的调查可能已经低估了几个数量级HBDS的丰度，并提供了一个可能的解释-太平洋高固氮率与先前在该地区估计的低浓度固氮生物之间存在矛盾。总的来说，该研究强调需要重新评估HBDs在海洋初级生产中的作用。由于它们对氮循环的贡献尚未得到证实，因此进行额外的环境调查，转录分析和培养工作对于确定海洋中HBD的生活方式以及确定支持水中固氮的机制和环境条件至关重要。
参考文献：1）S.Sunagawa et al.,Structure and function of the global ocean microbiome. Science 348, 1261359 (2015).
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