生物活性材料诱导软组织修复过程的免疫微环境探究

文章信息

文章题目：Dissecting the microenvironment around biosynthetic scaffolds in murine skin wound healing

发表期刊：SCIENCE ADVANCES
日期：26 MAY 2021
链接：https://advances.sciencemag.org/content/7/22/eabf0787
作者：四川大学华西口腔医学院满毅教授团队

摘要：

  • 许多研究表明：生物材料的结构特性可以影响细胞迁移状态与材料周围免疫反应。
  • 该研究使用静电纺丝技术制备了具有不同表面形貌（随机、网格、取样）的生物材料，利用全层伤口模型探究其对伤口愈合的影响及免疫系统的调控作用。
  • 首次利用单细胞测序技术在单细胞水平解析了不同结构材料周围的微环境，结果提示材料的植入能够影响整体免疫反应进程，取向型材料组提前了以T细胞为主导的适应性免疫反应。
  • 研究中使用单细胞分析方法得到的信息可以为未来免疫调节性生物材料的设计提供参考，以改善伤口愈合和组织修复。

实验设计：

重点采用小鼠探究材料周围免疫微环境

  • Electrospinning of polymer scaffolds
  • Characterization of scaffolds
  • Cell culture and cell viability test
  • Excisional wound model & Model for subcutaneous implant placement
  • Single-cell encapsulation and library generation & Single-cell encapsulation and library generation
  • RNA-seq analysis
  • Real time qPCR
  • Fluorescence-activated cell-sorting analysis
  • Histological and immunofluorescent staining

首先利用大鼠全层伤口模型发现取向组诱导创缘再上皮化效果最好、皮肤附属器官再生更多，皮下模型提示取向组的纤维沉积更少，伤后7天皮肤组织bulk 测序（n=3）提示取向组材料显著上调了免疫反应相关基因。

进一步利用小鼠模型也得到了同样的结果，伤后7天bulk 测序（n=3）提示取向组显著提示了炎性反应及免疫细胞迁移、趋化相关基因。

接下来，作者首先收集术后7天的取向材料组、空白对照组小鼠（n=4）背部皮肤样本进行单细胞测序(10x Single Cell 3′ v3) ，无监督聚类将其划分26个细胞亚群，属于 12个生物学亚群：

  • keratinocytes (KER)
  • fibroblasts (FIB)
  • sebocytes (SEB)
  • smooth muscle cells (SMC)
  • endothelial cells (EC)
  • Schwann cells (SC)
  • melanocytes (MEL)
  • innate lymphoid cells (ILC)
  • monocyte-macrophages (MAC)
  • T cells (TC)
  • neutrophils (NEU)
  • dendritic cells (DCs)

Ctrl样本中显著增加表达与巨噬细胞相关的基因（Itgam、Cd68、Arg1和Mrc1)。

对角质形成细胞进一步降维聚类，发现取向组有更多毛囊增殖期的细胞成分（Hair follicle progenitor cells 和 highly proliferative IRS cells）这也许能够解释取向材料组更丰富的附属器官再生现象。

对成纤维细胞降维聚类分群，提示取向材料组有更多的乳头层[PF2 (papillary fibroblast 2)],真皮层[DF (dermal fibroblast)],皮下 (HDF2)及肌成纤维细胞，印证取向材料组诱导创面更丰富的细胞外基质沉积。

在免疫细胞的数量上，结果提示材料组的巨噬细胞、中性粒细胞少于空白对照组，而效应T细胞增多。进一步关注这3类免疫细胞，对它们进一步聚类分析。

首先关注巨噬细胞，该研究通过无监督聚类得到了4个巨噬细胞亚型，根据其各自的差异基因选出标记基因、并用流式验证了可以通过实验分离出这些细胞类群，通过相关性检验和Monocle分化轨迹分析判断了各亚群之间的分化关系。尽管同样得到了表达促炎性基因的促炎性巨噬细胞、表达与炎症消退相关的抗炎型巨噬细胞，但是这些细胞亚群的基因表达并不等同于传统的M1型和M2型细胞。传统的M2型巨噬细胞标记物如Arg1和Socs3，几乎表达于所有巨噬细胞群体，一些传统的M1标记物也看到了类似的情况，说明了免疫细胞在体内环境下的异质性问题。

进一步关注有组间差异的中性粒细胞，降维聚类提示空白对照组有更多的Nue1、Nue2细胞聚集。

T细胞被进一步降维为四个亚群：、PT1（Birc5、Mki67和Stmn1），AT1（Cd7、Cd3g和Areg），AT2（Xcl1和Sult2b1），而AT3高表达与细胞毒性T细胞（Cd8b1）、TH1细胞（Ifng和Ptpn18）和TH17细胞（Il17a和Il17f）相关的上调基因，提示可能包括多种效应性T细胞。AT1和AT2亚群中更多来自Ctrl样本，而更多的效应T细胞和PT则来自取向组的样本。蛋白质组学分析显示，取向组表达了更高的TAP1和TAP2（抗原加工相关的转运体）。GO富集显示，在取向样本中，MHC蛋白结合(P = 0.0059)和TAP复合物(P = 0.0059)的蛋白富集。InterPro分析也表明在取向组中有丰富的TAP (P = 0.00205)，证实了取向样本中T细胞活性的升高。

进一步利用Cellchat进行免疫细胞与角质形成细胞、成纤维细胞间互作分析。

使用scRNA-seq进一步探索随机、网格和取向组材料之间的细胞组成和基因表达的差异。无监督聚类将细胞分为25个类群，巨噬细胞（AIM2和PIM2）的数量与愈合参数（残余伤口面积和纤维化沉积厚度）之间没有明显的相关性。因此，该研究认为抗炎和促炎的巨噬细胞不是影响伤口愈合的主要细胞类型。

而AT2细胞的数量与纤维化沉积的厚度呈正相关（P = 0.017和R2 = 0.999）。同时，TH17细胞（P = 0.039和R2 = 0.996）和AT1（P = 0.021和R2 = 0.996）细胞的数量与IB角质细胞（Ifi202b+ Plet1+ Plk2+ Krt6a+ ）的数量负相关。新形成的表皮厚度与CTL的数量呈负相关（P = 0.116和R2 = 0.967）。在此基础上，该研究提示T细胞的数量可能影响纤维化反应、皮肤附属物的形成和再生表皮的结构。

利用免疫缺陷小鼠验证：和WT小鼠相比，术后7天时Rag2-/-小鼠的新上皮更厚，其特点是棘层和角质层的增生，且缺乏皮肤附属物的再生。

综上，在取向材料植入情况下，创面炎症期末、修复期初始的免疫微环境发生变化，固有免疫细胞减少、效应T细胞增加提示材料可能促进免疫应答向后期的适应性免疫推进。未来仍需要进一步探究T细胞调节毛囊新生的具体机制，以及支架结构对伤口愈合过程的机械和生物影响。

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