科研 | 斯坦福医学院：右心适应性肺动脉高压的靶向蛋白质组学
编译：彭翰林，编辑：Tracy、江舜尧。
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肺动脉高压（PAH）的特征是进行性的闭塞性血管重塑导致的右心负荷增加。最初右心室（RV）会通过增加其壁厚来适应该改变（适应表型），但PAH的进一步发展通常会引起RV增大和衰竭（适应不良表型），从而导致需要进行肺移植甚至死亡。从适应性RV向适应不良性RV过渡的病理生理学机制尚未得到很好的阐明，部分原因是很少有PAH相关研究关注在右心适应不良表型（RHMP）的标志物上。以RV为中心的模型的预后价值等同于REVEAL评分（REVEAL评分是一种广泛采用的PAH风险分层工具，需要更广泛的临床数据和侵入性血流动力学措施），基于这些右心评分，我们的主要目标是鉴定PAH中RHMP的新型循环蛋白质组学生物标志物。我们假设PAH患者可能表达与RHMP相关的特定的血液蛋白质组，而与肺部疾病的严重程度无关，我们还想检查RHMP蛋白质组学标记物与生存的关系，寻求评估末期PAH患者的RV样品中RHMP标记的组织水平表达以及RV压力超负荷的实验小鼠模型，以检验循环水平升高反映RV过表达的假说，并验证用于未来机理研究的肺动脉束带模型（PAB）。
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实验设计
（1）PAH队列和对照队列的蛋白组学分析
（2）Standford和Mayo评分鉴定蛋白标记物和RHMP之间的关系
（3）对照组和PAB小鼠的生物标记物表达水平鉴定
实验结果
1.PAH患者RHMP的蛋白质组学分析
表1总结了发现队列的基线特征，包括以下几个方面：高水平的肝生长因子（HGF），干细胞生长因子（SCGFβ或CLEC11A），神经生长因子（NGF）和基质细胞衍生因子1（SDF1或CXCL12）；更高的Mayo和Stanford评分；同时伴有RV相关功能障碍（RVLS），RV不良重塑（RVESRI），更高的NT-proBNP和较差的NYHA功能类别（图1A）。
验证队列中的女性比例比发现队列中的女性比例更高，肺部疾病特征更严重，接受背景治疗的患者更少，发生事件的频率更高（表1）。在两个队列中，REVEAL，Mayo和Stanford的风险评分分布相似。高水平的HGF，SCGFβ，NGF和较小程度的SDF1、较高风险的Mayo和Stanford评分、RV功能障碍、较高的NT-proBNP和较差的NYHA功能类别相关，但与肺部疾病严重程度无关（图1A）。我们在两个队列中均未发现测量的细胞因子与良好的右心指标呈正相关。
图1B-C比较了在这两个队列里低，中和高风险RV患者亚组与88位健康对照的4种候选RHMP标记水平。
图1（a）队列中每种细胞因子的重要性分数（VIP）和相关性与右心得分和指标的相关性。使用偏最小二乘回归评估了血浆蛋白质组学标记（使用多重免疫测定）和右心适应不良表型，在121位PAH患者（2008-2011年的发现队列）和76位（2012-2014年的验证队列）中进行。正相关以红色显示，负相关以蓝色显示。（b）根据右心适应不良表型的水平，鉴定肺动脉高压（PAH）和对照组中四种标记物的水平。根据Stanford RH评分（上图）或Mayo RH评分（下图）的三分位数，分析PAH患者和88位健康对照者与右心适应不良表型相关的4种PHMP生物标志物的水平。
表1 发现和验证队列的基线比较特征
值表示为平均值±SD或数字（百分比），或中位数和四分位数范围（IQ）。显着的p值（<0.05）以粗体显示。RVSP是根据194个患者（85％的患者）的TR信号估算得出的。NYHA：纽约心脏协会；PAH：肺动脉高压；RV：右心室；RVESAI：在体表面积上索引的RV舒张末期面积：RVFAC：面积变化分数；RVLS：自由壁纵向应变；RVSP：右心室收缩压；TAPSE：三尖瓣环平面收缩期偏移
2.HGF的预后价值
在3.14年，有76例患者达到了主要终点（住院58例，移植了10例，总共41例死亡）。主要终点的无事件生存率（±标准误差）在1年时为91±2％，在3年时为78±3％，在5年时为62±34％（图2A），而49位患者达到了死亡或移植的次要终点。使用单变量分析，HGF和SCGFβ与主要终点相关，而NGF和SDF1a没有关系。根据HGF（p<0.001）和SCGFβ四分位数（p = 0.002）得出的主要终点的Kaplan-Meier生存曲线如图2B所示，在Mayo，Stanford和REVEAL评分中增加了HGF显著的增值，以预测3年时的主要终点（p <0.01，图2C），HGF和SCGFβ均与死亡或移植的次要终点有关。
图2 肝生长因子（HGF）的预后价值及其对进行结局预测的风险评分的增量值
（a）主要合并终点的五年KaplanMeier生存曲线（n = 197）；（b）根据基线时HGF水平的四分位数；（c）Cox回归分析。
3.缺乏心脏纵向重构的生物标志物
在总人群中，有174例患者在1年后接受了超声心电图检查。无论研究期间是否开始治疗，基线时的4种RHMP生物标志物均未发现与右心重塑的改变有关；同样，基线时的Stanford评分，Mayo评分和NTproBNP与随访时右心重塑的改变无关。
4.RHMP生物标志物在人RV组织中的表达
在PAH患者的RV标本中，HGF及其受体c-Met的蛋白质水平高于对照组（图3）。与对照组相比，PAH中的NGF含量降低，其受体TRKA表达升高。
在PAH患者中，通过Picro-Sirius Red染色面积百分比评估的RV纤维化水平为11.5％，在PAH病因学方面相似。图3显示了特发性PAH患者的RV样品中4种生物标志物和受体的定位，两名PAH患者（特发性和BMPR2突变）均显示相似的蛋白RV表达。c-Met与心肌细胞，平滑肌细胞，内皮细胞和成纤维细胞标志物共定位，在较小程度上与巨噬细胞共定位。HGF呈点状表达，呈囊泡状，在心肌细胞，平滑肌细胞和成纤维细胞中含量较高，在巨噬细胞和巨噬细胞中含量较低。TRKA和NGF均与心肌细胞，平滑肌细胞和巨噬细胞共定位，而TRKA另外与成纤维细胞共定位，而NGF与内皮细胞共定位（图3）。SCGFβ存在于心肌细胞，平滑肌细胞和成纤维细胞中，而SDF1在心肌细胞，平滑肌细胞，内皮细胞和巨噬细胞中存在。
图3 c-Met（A，红色）及其配体HGF（B，红色）在特发性肺动脉高压患者的右心室活检中通过免疫染色的定位
5.PAB小鼠中生长因子Hgf，c-Met，Ngf和Scgfβ的RV表达改变
与对照组相比，PAB RV匀浆中Hgf，c-Met和Ngf的RNA表达显着增加，而Sggβ的表达显着降低（图4）。
图4 在肺动脉带状小鼠的RV中，与对照相比，HGF，c-Met，NGF和SCGFb的基因表达
讨论
先前的PAH蛋白质组学研究发现了与肺血管疾病严重程度和预后相关的血液特征，该研究利用无监督的机器学习来识别具有明显炎症特征的PAH表型。现在越来越多的证据表明，PAH患者的炎症和RV衰竭与实验性疾病模型之间存在关联，但是之前的蛋白质组学筛查研究都没有以右心为中心。最近的影像学研究已大大改善了PAH的右心适应性表型的鉴定，将RV自由壁纵向应变（RVLS）和收缩末期尺寸（例如重塑指数RVESRI）确定为RV适应性的强心动图标记。这些标记均已与纽约心脏协会（NYHA）功能类别和N端前B型利尿钠肽（NT-proBNP）整合在一起，以定义RHMP得分（Mayo诊断模型：基于RVLS，NYHA类和NT-proBNP；斯坦福诊断模型：RVESRI，NYHA类和NT-proBNP）。本研究运用具有针对性的蛋白质组学研究确定了与RHMP相关的四种循环细胞因子，并证明与肺血液动力学的严重性无关。HGF在3年时可作为临床恶化的有力预测指标，并增加到REVEAL评分中。PAH患者的RV在心肌细胞，平滑肌细胞和内皮细胞中的cMet和HGF蛋白表达增加，PAB小鼠模型进一步证实了Hgf和c-Met的基因表达增加，这表明PAB是进一步研究RV对PAH的适应性相关的有效模型，并解答了增加HGF表达是有利或有害的问题，这种方法使我们将血液用作PAH右心衰竭的窗口，从而将HGF /c-Met鉴定为感兴趣的潜在信号通路。
HGF是一种间充质来源的多效性细胞因子，与它的酪氨酸激酶受体c-Met结合。HGF /c-Met信号通路可促进血管生成，心肌细胞存活并抑制实验性心肌梗塞和左心肌病模型的纤维化和血管通透性以及炎症。尽管HGF对左心有心脏保护作用，但一些研究反常地报道了HGF的高循环水平与几种压力超负荷的心脏病（高血压和主动脉瓣狭窄）或晚期缺血的左心室重塑，功能障碍等相关。
关于HGF /c-Met在右心脏中的分子作用的证据很少。据报道，在小群患有硬皮病相关性或特发性PAH且HGF与MPAP相关的患者中，HGF水平较高，我们的研究进一步证明了高血浆HGF水平与RHMP的相关性超出了肺部疾病的严重程度。在纳入人口统计学、患病率/发病率以及功能严重性方面不同的两个队列之后我们进一步证明了所鉴定的生物标志物与跨PAH病因的RV适应性相关。高HGF水平与我们队列中的结局密切相关，为REVEAL风险评分增加了增值，暗示HGF /c-Met轴在右心脏的作用。四种RHMP生物标志物均与基线时右心评分或NT-proBNP水平（经验证的预后标志物）无关联，与右心重塑的改善无关，这说明了预后标志物对治疗的反应。未来的研究应调查从基线到1年生物标志物水平的变化是否与右心重塑的变化相关。
虽然PAH中HGF血浆水平升高的起源仍有待充分阐明，但我们报道了HGF和c-Met的蛋白表达在PAH患者中增加，另一个发现是这些标志物在PAH患者的RV中的定位，表明HGF /c-Met的多效性作用如先前在左心室中所证明的类似。与其他对照组相比，其他标志物在PAH患者的RV样品中并未显示出这种增加的表达，尽管受到可用样品数量的限制，但这值得进一步研究。
动物模型为循环HGF水平的潜在来源带来了一些见解。据报道，在古灵碱诱导的PAH中，在2周时HGF血浆水平升高，这与在4周时HGF和c-Met的RV mRNA表达增加相关，但在肝脏中则不存在，这表明HGF是心脏而非肝脏来源。我们的PAB模型进一步证明，与对照组相比，PAB RV匀浆中HGF和c-Met的基因表达增加，这表明PAH患者外周血和右心室中HGF循环水平的增加可能反映了HGF产生的增加。但这些数据不能得出关于RV中HGF增加是否反映了RV适应后负荷增加的补偿性尝试，或者它是否代表了适应不良有害反应的结论。
此前已经讨论了HGF作为PAH疗法的潜在有益作用，HGF增加了骨形态发生蛋白受体2的表达，其激活有益于PAH和RV衰竭。几种动物模型（例如，由单肾上腺素诱导的PH大鼠，具有分流诱导的PH兔子）显示，外源性HGF或HGF基因转染可降低PH的发展，与对照组相比，右心肥大的症状减轻和炎症性状也降低；然而，HGF / c-Met轴激活在右心脏中的及时性和直接作用仍有待阐明，在此PAB模型对于探索血浆和组织中HGF表达的动态变化可能具有特殊价值。
总之，血浆高水平的HGF与PAH中的RHMP有关，与肺部疾病的严重程度无关，并且对于预测结果而言，其REVEAL评分会增加。由于PAH中RVHGF-cMet蛋白和基因表达均增加，因此该途径作为潜在的RV特异性治疗靶点值得进一步探索。