科研 | Microbiome：小麦根系相关微生物群落在植物发育和氮肥共同作用下的变化(国人作品)
编译：沐秋，编辑：小菌菌、江舜尧。
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背景：植物根在根内和根际组装微生物群落，且这些与根相关的微生物群落在植物营养和生产力中起着关键作用。众所周知，过去50年来，中国农田中合成肥料的增加不仅增加了产量，而且也带来了环境问题。但我们对养分输入增加下的作物如何形成根系相关微生物群落缺乏全面的了解，尤其是通过调节根系代谢物和分泌物的数量和组成。
方法：在分蘖期、拔节期和成熟期，研究了4种长期无机氮水平下小麦根和根际的细菌和真菌群落的组成。测定了根际土壤有机碳（SOC）和土壤活性碳（SAC）含量、根系分泌物中有机碳（ROC）、有机酸含量。
结果：ROC水平在小麦不同生长阶段差异显著，与细菌群落的相关性大于与真菌群落的相关性。长期施氮可提高根际土壤有机碳(SOC)和土壤活性碳(SAC)水平，但各生育期差异不大。根际微生物群落结构随施氮量的增加呈下降趋势。此外，与分蘖期相比，在拔节期和成熟期的细菌和真菌属明显增多。许多因施氮而改变的细菌属，包括节杆菌属、芽孢杆菌属和德沃斯氏菌属，与乙酸、草酸、琥珀酸和酒石酸水平显著相关。
结论：植物生长状况和氮素输入均驱动小麦根区微生物群落结构的变化。植物生长期对细菌的影响大于对真菌群落组成的影响。许多被描述为植物根际促生菌（PGPR）的细菌属与氮肥施入正相关，且丰度与有机酸水平显著相关，表明植物分泌的有机酸可能是植物在根区招募有益微生物以应对高氮输入的策略。这些结果为深入研究集约农业生态系统中氮输入增加、碳有效性改变和植物根与根际微生物群落的变化之间的关系提供了新的视角。
论文ID
原名：Root-associated microbiomesof wheat under the combined effect of plant development and nitrogen fertilization
译名：小麦根系相关微生物群落在植物发育和氮肥共同作用下的变化
期刊：Microbiome
IF：11.356
发表时间：2020.1.22
通讯作者：胡春胜，刘彬彬
作者单位：中国科学院遗传与发育生物学研究所
实验设计
1 试验安排和取样
1998年在河北省栾城县栾城农业生态系统试验站（北纬37°53′，东经114°41′，海拔50米）开展了长期氮肥田间试验。试验包括四个施氮水平，分别为每个小麦生长期0、100、200和300公斤N/公顷，施于3个重复的地块。土壤为潮土，pH值为7.53-7.95，总碳（TC）为17.03-20.80 g/kg，总氮（TN）为1.13-1.70 g/kg。在2016年11月（Feekes生长期2-3）、2017年3月（Feekes生长期6-7）和2017年5月（Feekes生长期11）分别采集了三次根际和根样品，本研究称之为分蘖期、拔节期和成熟期。分别从各生育期不同施氮水平的植物中采集了3个重复的根芯样本，本研究中的根际样品严格定义为根表2 mm范围内的土壤。在轻轻摇动根部以去除松散附着的土壤团块后，通过清除根部的残留土壤仔细收集根际样品。为了减少对附着在根部的丛枝菌根真菌和下游DNA提取的影响，用无菌蒸馏水冲洗根，用于根分泌物和根微生物群落分析。因此，我们将本研究中的“根微生物群落”定义为根内和根表面的微生物群落，因为样本采集方法没有区分这两个部分。
2 SAC、SOC、ROC和有机酸的测定
由于只对根际和根系样品进行了调查，本研究中的土壤有机碳（SOC）和土壤活性碳（SAC）是指根际SOC和SAC。SOC是用传统的方法定义的，是指土壤中有机化合物的碳组成。根释放有机碳（ROC）在本研究中定义为根分泌物中的总碳。用高锰酸钾（KMnO4）氧化C法测定SAC。用K2Cr2O7—H2SO4氧化法测定SOC。
将0.4g新鲜根与1.5ml无菌去离子水以1400rpm振荡30min，提取根分泌物。样品随后在13000×g下离心5min，上清液通过0.22μm过滤器过滤。然后，使用总有机碳分析仪对0.5 ml上清进行ROC测定。使用配备反相硅胶C18柱（Atlantis T3250×4.6 mm，5μm，Waters）的高效液相色谱仪（Waters e2695，Milford，MA，USA）测定有机酸；用20 mm磷酸钠缓冲液（pH 2.73）以0.5 mL/ min的流速在30°C下洗脱10μl根分泌物样品。测定在210 nm处的吸光度，并且用标准有机酸制成标准曲线。
3 DNA提取和PCR扩增
总基因组DNA通过使用E.Z.N.A.®土壤DNA试剂盒(Omega Biotek, Inc., Norcross,GA)按照说明书从0.5 g的根际土壤或用液氮研磨得到的0.4 g的新鲜根粉中提取。分别用341F:785R和FR1:FF390引物对16S和18S rRNA基因进行扩增。PCR反应体系为25μl，其包含12.5 μl预混料(Phanta高保真度DNA聚合酶,Vazyme生物科技有限公司,中国),1 μl引物(10μM),和 1μl DNA模板(大约20 ng的DNA)。PCR条件为:95℃，3 min;95°C 30 s, 55°C 30 s, 72°C 30 s 25个循环;最后在72°C下延长10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，然后使用AMPure XP beads（Beckman Coulter，Inc.，Brea，CA）按照说明书纯化。随后进行8个循环的PCR，将双索引条形码和Illumina测序接头添加到每个样本中，然后用AMPure磁珠对PCR产物进行纯化。使用Illumina MiSeq PE300平台（中国苏州GENEWIZ）对每个样本的等量PCR产物进行混合和测序。
4 测序数据分析
利用微生物生态学的定量研究(QIIME)程序分析序列。在每次读取结束时移除接头序列、条形码和以及每个读长末端的30个低质量碱基，之后使用fastq-join方法以最小重叠区为20bp，重叠区10%的最大错配率进行正向和反向读长拼接。丢弃低质量序列（Phred质量评分Q < 20或长度小于200 bp），并在USEARCH程序中使用UCHIME算法过滤掉嵌合体。使用UCLUST方法将高质量的数据以97%的相似性聚成可操作的分类单元（OTUs）。SILVA 16S和18S rRNA数据库分别用作细菌和真菌参考数据库。去除singletons和非细菌或真菌的OTUs后，对高质量序列进行分析。
在完成质控后，分别从根际和根际样品中获得9003-33523和5811-27012个细菌序列，根际和根样品的细菌OTU表分别被细分为8500和5500个序列。亚取样序列聚类为根际样品1002-3256个OTUs（平均2588个），根际样品817-2031个OTUs（平均1573个）。对于18S rRNA基因序列，质控后分别从根际和根样品中获得4777-29260和1492-5413个高质量序列。根际和根样品的真菌文库分别为每个样品4000和1000个序列。将亚取样序列聚类为根际样品704-1084个OTUs（平均895个），根际样品192-301个OTUs（平均263个）。基于合并序列的相似性（ANOSIM）初步分析表明，细菌和真菌群落的根际和根样品之间存在显著差异（P<0.001），因此，分别对根际和根样品进行序列分析。
5 数据分析
使用SPSS20.0（IBM，芝加哥，美国）和R进行统计分析。采用SPSS 20.0软件进行方差分析和最小显著性差异（LSD）分析，检验施氮水平对土壤有机碳、土壤活性炭和根系分泌物的影响。利用R中的vegan包进行冗余分析和Mantel检验，以确定碳库和OTU水平上微生物群落之间的相关性。利用R中的psych包对有机酸与细菌类群、细菌类群与真菌类群进行Pearson相关分析，利用Bray-Curtis相异性距离矩阵进行ANOSIM分析，以确定根和根际样品之间细菌和真菌群落的显著差异。
结果
1 根际和根系分泌物中的碳
土壤活性炭（SAC）是构成土壤食物网燃料的土壤碳的一部分，对养分循环有重大的影响。在所有生长阶段，N0对照（不施肥）样品的根际土壤活性炭显著低于N100、N200和N300施肥处理（每个小麦生长期分别为100、200和300 kg N ha-1）的小麦，虽然在大多数肥料处理样品中没有观察到显著的差异（图1a）。根际土壤有机碳（SOC）水平也表现出类似的规律（图1b）。鲜根单位重量释放的有机碳（ROC）如图1c所示。在分蘖期和拔节期，4个施氮水平的ROC差异不显著。成熟期，N200和N300的ROC显著高于N0和N100。在不同生长阶段，拔节期（2.23-2.43mg/g根）的ROC水平高于分蘖期（0.30-0.34mg/g根）和成熟期（1.08-1.77mg/g根）。值得注意的是，报道的浓度被归一化为根重，总ROC随施氮水平的增加而增加。
本研究测定了8种有机酸（乙酸、草酸、丙酮酸、延胡索酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸和柠檬酸），除丙酮酸和延胡索酸外，其余均在根样中检出。有机酸的含量和组成随生长阶段的不同而不同（图1d）。分蘖期有机酸浓度之和为0.06-0.10mg C/g根，以琥珀酸、柠檬酸和苹果酸为主，分别占所测有机酸的46-62%、17-26%和14-20%，拔节期有机酸总量为0.39-0.76mg C/g根；以琥珀酸为主，占有机酸总量的82-87%。成熟期有机酸浓度之和为0.14-0.23 mg C /g根，其中柠檬酸和苹果酸占主导地位，分别占有机酸总量的55-92%和7-17%。
2 细菌群落对植物生长发育和施氮的响应
对三个生长阶段和四个施肥水平下的小麦根际和根样进行高通量测序。不同生育期和施氮水平下根际和根样中的细菌群落组成如图2所示。在根际样品中，分蘖期4种施氮水平下的细菌群落组成差异显著（图2a）。随着施氮水平的提高，拟杆菌门的相对丰度降低，而放线菌门和变形菌门的相对丰度增加。拔节期和成熟期4个施肥水平下的土壤细菌群落组成均较分蘖期相似。在根样中，变形菌门、放线菌门和拟杆菌门是三个优势菌门（图2b）。随着施氮水平的提高，放线菌门的相对丰度降低，而厚壁菌门的相对丰度在拔节期显著高于其它两个时期。
主坐标分析（PCoA）在操作分类单元（OTU）级别进行。根际（图2c）和根样（图2e）的OTUs在植物生长期都有明显的分离，而根际氮肥效应只在分蘖期出现。计算了各施氮水平下三个生长阶段间的差异距离，各生长阶段微生物群落结构的差异随根际施氮水平的提高呈下降趋势（图2d）。基于OTU水平上微生物群落结构的冗余分析（RDA）表明ROC与细菌群落显著相关，分别占根际和根样变化的19.0%和12.7%（表1），Mantel检验结果也表明ROC与细菌群落具有显著的相关性（表2）。
绘制了细菌群落在三个生长阶段和四个施肥水平下的微生物群落组成差异在目和属水平的热图（图3a、b）。在目水平上，拔节期和成熟期根际样品中的微囊菌、丙酸杆菌、盖菌、杆菌和根瘤菌的相对丰度显著高于分蘖期（图3a）。在根样中，拔节期杆菌、乳酸杆菌和伯克氏杆菌的相对丰度显著高于其它两个时期。分蘖期根瘤菌和鞘氨醇单胞菌的相对丰度与施氮水平呈正相关，而根样中链霉菌的相对丰度在各生育期呈相反趋势（图3b）。在属水平上，根际样品中节杆菌、单孢原菌、诺卡氏菌、链霉菌、芽孢杆菌和德沃斯氏菌在拔节期和成熟期的相对丰度显著高于分蘖期。在根样中，微杆菌、节杆菌、鞘氨醇单胞菌和德沃斯氏菌的相对丰度与施氮水平呈正相关，而链霉菌与各生育期施氮水平呈负相关。此外，拔节期芽孢杆菌、海洋杆菌和乳球菌的相对丰度显著高于其他生长期。
Mantel检验表明，6种有机酸与根细菌群落显著相关（表2）。为了深入了解细菌群落对有机酸的反应，对这六种有机酸与细菌目（图3a、b）和属进行了进一步的相关分析。乙酸、草酸、琥珀酸和酒石酸与根际样品中的微球菌目、芽单胞菌目、偶氮螺菌目和伯克霍尔德氏菌目及根样品中的鞘脂杆菌目、芽孢杆菌目和乳酸杆菌目呈正相关，而与根际样品中的噬几丁质菌目、噬纤维菌目、糖胞菌目和假单胞菌目及根样品中的噬纤维菌目，纤维细杆菌目，糖胞菌目和粘球菌目呈负相关(图3a, b)。在属水平上，乙酸、草酸、琥珀酸、酒石酸与根际样品中的节杆菌属、德沃斯氏菌属、马赛菌属及根样品中的节杆菌属、微单孢菌属、野野村菌属、土地杆菌属、芽孢杆菌属、海洋杆菌属、乳球菌属、马赛菌属和寡养单胞菌属呈正相关而与根际样品中的噬几丁质菌属、农研丝杆菌、Taibaiella、Ohtaekwangia、Mucilaginibacter和Acidibacter及根样品中的农研丝杆菌和Ohtaekwangia呈负相关。
根际和根样中的真菌群落在门水平的组成分别如图4a和图4b所示。子囊菌在根际和根样品中均占优势（>75%）。在根际样品中，壶菌相对丰度在拔节期高于分蘖期，接合菌的相对丰度在拔节和成熟期高于分蘖期（图4a）。根际样品的优势真菌目（相对丰度>1%）为煤炱目(5-17%)、格孢菌目(5-31%)和肉坐菌目(13-30%)，根样中占主导地位的真菌目(相对丰度>1%)为煤炱目(6-23%)、格孢菌目(5-30%)和肉坐菌目(20-62%)。所鉴定的真菌目对施氮和植物发育阶段均没有明显的响应模式，除根际的Calosphaeriales、Hypocreales和Sordariales外，均与根际施氮水平呈正相关；根样中的格孢菌目相对丰度随植物生长而增加。在属水平的群落组成上，镰刀菌为优势属，分别占根际和根样相对丰度的9-23%和16-47%。与细菌群落的PCoA相比，基于OTUs相对丰度的真菌群落的PCoA在根际和根样品的生长阶段中没有显示出明显的分离（图4c和e）。尽管如此，与对细菌群落的观察一致，在根际样品中观察到随着施氮量的增加，不同生长阶段之间的差异距离呈下降趋势（图4d）。RDA表明SAC和SOC分别占根际真菌群落变异的12.6%和14.8%，显著高于ROC（表1），说明根际碳对真菌群落的影响很大。Mantel检验表明根样本中SAC和真菌群落之间存在显著相关性（表2）。
对根际和根样中的细菌和真菌之间在三个生长阶段的相关性进行了评估。采用相对丰度大于1%的属进行分析，根际样品中有39个细菌属和24个真菌属，根样品中有45个细菌属和24个真菌属。在根际样品（表3和图5a）的细菌和真菌中，分蘖期、拔节期和成熟期分别有123、82和100个显著相关（p<0.05）。分蘖期的细胞弧菌、念珠菌和假黄单胞菌以及成熟期的念珠菌和节杆菌与9个以上的真菌属显著相关。根样中的细菌和真菌在分蘖期有106个显著相关，拔节期增加到128个，成熟期增加到130个（表3）。拔节期，假丝酵母菌、节杆菌和黄体杆菌与9个以上真菌属显著相关（图5b）。
讨论
氮肥施用是最重要的农业措施之一，在过去的半个世纪里促进了全球作物产量的增加，以往的研究表明，超过一定阈值的过量施氮并不能促进作物的进一步增产，反而会导致大量的氮素损失，造成了一系列的环境问题。氮肥的过度使用是当前我国农业生产中的主要问题之一，特别是在华北平原等农业集约化地区，提高氮肥利用效率、降低氮肥水平仍然是一个挑战。由于细菌和真菌在根区氮素转化中的重要作用，有必要对根相关微生物对氮肥的响应进行全面的研究，特别是与根系分泌有关的研究，这已被证明对植物吸收氮至关重要。
在本研究中，不同施氮处理（N100、N200和N300）根际土壤活性碳（SAC）和土壤有机碳（SOC）含量均显著高于对照（N0）。这些变化可初步归因于长期施氮增加了根系生物量和根系分泌物总量。此外，由于作物残体被还田，长期来看，由于施氮而增加的地上作物生物量也有助于提高SAC和SOC水平。根际土壤活性炭(SAC)和土壤有机碳（SOC）没有随植物生长阶段的变化而变化，（图1），表明不同施肥水平下根际土壤活性炭(SAC)和土壤有机碳（SOC）的差异主要是由20年栽培过程中根系分泌物的累积变化和作物残体的还田造成的。
根际细菌群落结构在分蘖期因施氮水平差异而明显分离，但在拔节和成熟期聚集在一起（图2c）。由于ROC水平在拔节期和成熟期显著高于分蘖期，冗余分析（RDA）和Mantel检验均表明细菌群落与ROC密切相关。不同施氮水平下微生物群落间的相似性增加，这可能是因为根系分泌物的影响超过了根际氮有效性的影响。
促生根际菌（PGPR）与根密切接触，能够增强寄主植物在其环境中的适应能力。在本研究中，根际节杆菌、芽孢杆菌、马赛菌和德沃斯氏菌的相对丰度以及根中芽孢杆菌、海洋杆菌、乳球菌和马赛菌的相对丰度在拔节期和成熟期均高于分蘖期（图3a），这些属被认为是重要的PGPR。此外，Pearson相关分析表明，这些类群与一种或几种有机酸正相关（图3b）。有趣的是，节杆菌、芽孢杆菌和德沃斯氏菌也与氮输入水平呈正相关，对这些结果的一个可能解释是，植物通过分泌有机酸来招募PGPR，从而对施氮水平增加作出响应。事实上，已经有研究表明通过根分泌的有机酸会招募PGPR。
不同施氮水平下，三个生育期的有机酸组成和数量也发生了变化。这可能是因为施氮水平增加改变了植物的生理状态。对这一现象的另一个可能解释是，过量的氮输入导致土壤中其他养分如磷酸盐的消耗。调节根系分泌物的数量和组成是植物为了应对有限的养分而发展起来的一种策略。为了支持这一观点，有机酸的分泌被认为是从土壤中的无机复合物中释放磷酸盐的有效途径。
结论
植物发育和长期施氮都对根系相关微生物的结构有重要影响。在根区，细菌群落组成与根释放的有机碳密切相关，而真菌群落与根际土壤活性炭相关。植物生长期对根和根际细菌和真菌群落的相关性有不同的影响。大量的植物根际促生菌PGPR与有机酸和施氮水平相关，表明分泌有机酸以招募有益微生物可能是植物应对氮素输入的重要策略。这项研究是朝着更机械地理解微生物群落组成的变化如何调节和反映在集约农业生态系统中氮输入的影响迈出的一步。
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