以往研究中，关于母亲产前压力和儿童行为结果之间的显著关联经常被一些会影响产后抚养环境但又与产前压力相关的因素所混淆。本研究的主要目的是要确定母亲产前压力是否与婴儿出生前大脑功能连接的变化有关。我们使用118个胎儿（48位女性，平均年龄32.9周（SD=3.87））的fMRI数据来评估这种关联，并进一步探讨胎儿神经系统的差异是否与母亲的健康行为、社会支持或生产有关。在本文中，作者使用了脑网络研究中最常见的InfoMap的社区检测方法（就是ICA的默认方法）来定义网络，通过对模块化的分析可以提取网络内或网络间的不同连接效应。然后，作者将基因富集分析的方法在本文中进行了迁移，通过将母亲的负性压力因子和网络连边进行一一配对，在其后使用fisher-z精确值检验来确定母亲的负性压力因子和胎儿的网络连边之间的关系。其后，使用混合模型来测试胎儿的神经差异是否与母亲的健康行为、社会支持或生产有关。研究发现，产妇产前负性情绪/压力的增加与胎儿额叶、纹状体和颞叶连接的改变有关（β = 0.82，p < 0.001）。后续分析表明，这些关联在有更好的健康行为、更积极的人际支持和更低的整体压力的女性中更强（β = 0.16，p = 0.02）。此外，与压力有关的神经连接性差异的大小与分娩时较小的胎龄略有关联（β = -0.18，p = 0.05）。我们的研究首次提供证据表明，怀孕期间的负面情绪/压力反映在子宫内胎儿的脑功能网络差异中，并且还提供了关于积极的人际关系和健康行为如何调节产前大脑网络关联的信息。本文发表在Neuropsychopharmacology杂志。如果母亲在怀孕期间承受了较高的心理或生理压力，她所生的孩子可能会因为这些早期的大脑规划事件而经历负面的后果。产前压力的伤害性影响横跨各个领域，包括增加精神疾病和神经发育障碍的风险，改变荷尔蒙和生理的身体反应，并增加对一系列疾病过程的易感性。对胎儿行为和生理的研究表明，母体产前压力甚至在出生前就可能影响胎儿的大脑发育。此外，早期压力暴露的负面后果似乎是持久的，甚至影响到成人神经退行性疾病的发病率，从而影响到长期的行为结果，并可能导致风险传递到后代。这一关键研究领域的一个长期挑战是，暴露在高产前压力下的母亲所生的孩子会经历更多的出生并发症，而且更频繁地在高压力环境中长大，这使我们无法从胎儿出生后的脑指标中得出胎儿大脑在出生前发生了改变的结论。动物研究表明，产前应激行为会导致树突更短且复杂性降低、髓鞘减少和突触发生改变。对新生儿和儿童的产后研究证实了这些观察结果，表明压力改变了新生儿和儿童的脑功能连接和脑结构发育。重要的是，儿童大脑结构的差异已被证明在一定程度上调节了产前压力和儿童时期情感问题之间的联系。尽管这些发现表明产前压力会改变胎儿大脑，对行为结果的产后检查构成了主要的限制。需要胎儿大脑被改变的前瞻性证据更有力地证明母亲产前压力会影响子宫内的人类大脑。本研究通过利用新兴的功能磁共振成像（fMRI）技术，首次评估母亲压力的变化是否以及如何与人类胎儿大脑的系统组织有关，从而解决这一问题。静息态功能连接（RSFC）fMRI最近被应用于研究胎儿大脑功能网络的发展。这种技术依赖于记录整个大脑的自发功能信号，然后评估信号之间随时间变化的共变和互动。表现出协同活动的脑区被认为是 "功能上相互连接的"，其解剖学基础已被证明。这项技术为胎儿大脑活动的全局协调和大脑网络的整体架构提供了迅速洞见。现在有证据表明，RSFC最初在子宫内发展，在非典型神经解剖学的胎儿中会发生改变，在性别之间有差异，与婴儿的行为结果有关，并且在早产胎儿中存在符合预期的减弱。本研究的主要目的是确定母亲产前压力是否与孩子出生前的大脑变化有关；第二是确定社会心理支持和健康行为是否影响这种关联；第三是测试在神经生物学上，母亲面临的产前压力是否与孩子的出生时间有关。当前，关于胎儿大脑功能网络发育常模的数据有限，因此，我们的假设集中在对大规模胎儿功能网络结构进行编码并且通常牵涉到精神疾病和神经发育疾病的中心区域。具体来说，我们假设母体产前负性情绪/压力（NAS）将与高级联合皮层，特别是前额叶和顶叶区域的连接性改变有关，以及与岛叶和颞叶区域的连接性有关。此外，由于压力的影响因人而异，我们进一步假设，较高水平的社会支持和适应性健康行为将缓和母亲NAS对儿童产前大脑发育的影响。最后，由于先前的工作将产前压力与早产联系起来，我们假设，母亲NAS与胎儿大脑连接性更高程度的相关将与婴儿更早的出生有关。胎儿神经影像学样本包括118例（48名女性），母亲平均年龄为25.1岁（SD=4.5）。排除条件包括20周超声检查确定的疑似胎儿中枢神经系统异常和/或MRI禁忌症（如心脏起搏器、母亲体内的铁磁物质、幽闭恐惧症）。进行MRI时胎儿的平均年龄为32.9周GA（胎龄）（SD=3.87；范围26-39周），出生时平均年龄为39.4周GA（SD=1.1）。本样本中的15个病例已经在之前的功能连接研究中被研究过，其中118个病例在最近的产前性别差异调查中被研究过。在MRI检查的1周内，由转诊医生进行超声检查以确定胎儿的GA。所有妇女在接受MRI检查前都提供了书面知情同意书。参与研究得到了韦恩州立大学人类调查委员会的批准。对研究参与者进行了纵向跟踪，以确保他们在怀孕期间没有出现并发症。被试亲子对的社会人口学特征和出生行为结果（N=118）见表S1，所有排除病例的汇总表见表S2。
压力的概念和测量会在一定程度上随着时间的推移而改变。以前对宫内压力影响的研究使用了生物学指标，如唾液皮质醇和焦虑、抑郁和压力的自我报告问卷。在这里，我们根据经验得出了一个代表产前消极情绪和压力（NAS）的单一因素，并在补充分析中在一组有皮质醇数据的被试中测试了这个因素和其所有子项与唾液皮质醇的关系。这种方法的主要优点是减少了共线性指标中进行的统计测试的数量，同时保持个体指标的高负荷。怀孕期间的母亲压力是用五个评估内化问题和压力的量表的汇总分数来评估的，即流行病学研究中心抑郁量表CESD、国家特质焦虑量表STAI-T、宾州忧虑问卷PSWQ、感知压力量表PSST和生活满意度量表SWLS。产前情绪和压力量表的描述性统计见表S3。考虑到压力暴露和负性情绪的方差，以及尽量减少模型的运行数量，我们在Mplus vs. 7.2中使用因子分析，得出产妇NAS指数。具体来说，在随机一半的样本中，我们对五个量表进行了单因素和双因素的探索性因素分析（EFA），EFA确定这些量表可以加载到一个单一的因子上（CFI=0.98，TLI=0.96，RMSEA=0.08，SRMR=0.03；所有因子加载，P<0.001）。接下来，我们在另一半随机样本中对这些量表进行确认性因素分析（CFA），以验证模型的拟合。同样，这五个量表显示了高负荷和对单因素模型的良好拟合（n = 99，CFI = .98，TLI = .97，RMSEA = .06，SRMR = .03；因素负荷，p < .001）。因此，我们在全样本中重新进行了CFA，以获得全样本中的单个NAS分数。该模型显示出对数据的良好拟合（χ2=10.23，P=0.07，df=5；CFI=0.98；TLI=0.96；RMSEA=0.07；SRMR=0.03），每个量表在NAS因子上都有明显的负荷（P<0.001）。图1中提供了各个因子的负荷情况。
图1 各因子的负荷情况
使用FSL图像查看器确定与胎儿最小头动相对应的脑图。然后对该张脑图进行来单独处理，并生成来一个三维mask。然后，使用这个mask来选择与该图像位置最临近的其他的图像，在这个过程中，只有相对该位置改变在控制范围内的图像才被保留下来进行后续分析。之后，每张图像都被手动调整方向，与平均BOLD像重新对齐，重新采样为2毫米的各向同性体素，并使用SPM8归一化到32周的胎儿大脑模板。对每个低头动段的运动参数进行检查，以确保筛选的图像至少有20秒（10帧）的时间。本研究应用的审查标准和之前的研究保持一致，即绝对头动的平动平均值在1mm以内，绝对头动的转动平均值在1.5度以内。由于严格的质量控制，平均有56%的数据被排除在分析之外。在剔除这些数据后，共获得118被试，平均159帧（SD=42）的数据。各受试者的平均平动和转动范围分别为0.01至0.52mm和0.6°至1.1°。在最后一步，为了降低被试内部各部分的归一化差异，用4mm FWHM的高斯核进行平滑。基于空间约束的组级聚类方法被用来将32周GA胎儿模板脑的区域分割成197个空间上连续的、大小相似的ROI。该方法利用归一化到32周胎儿模板空间的4D胎儿数据，通过评估给定数据集中体素时间序列的相似性，使用Pearson相关性，然后迭代合并显示最大群内相似性和最小群间相似性的体素，产生功能上同质的体素群（即cluster）。接下来，它使用归一化切割算法确定最具代表性的体素群，并进行组级聚类。这种方法产生的ROI跨越了皮质、皮质下和小脑区域的全部范围，在应用头动校正、归一化和连接步骤后，能够代表特定于这个胎儿样本的功能连接模式。这是一种已确立的数据驱动的分割方法，在人类胎儿大脑中非常有用，因为其先验因素是有限的，而且发育变化非常快。然后，我们对ROI按半球、脑叶和对应于质心的坐标进行了分类。使用CONN功能连接工具箱（v14n）可以对每个被试生成这197个ROI之间的Pearson相关矩阵。处理方法包括去线性漂移，使用从32周胎儿图谱白质和脑脊液mask中提取的五个主成分的CompCor进行噪声信息的回归，并对六个头动参数回归，在0.008-0.09Hz进行带通滤波。从个体FC（19,306个ROI-对，Fisher-z）建立组平均的197×197的连接矩阵(图2)。对组平均结果在多个Fisher-z值上进行了阈值化和二进制化，通过对应于从1%到10%的边密度稀疏度阈值范围，步长为0.1%，产生了91个邻接矩阵。<10毫米的ROI对之间的连接被删除，以尽量减少空间归一化fMRI数据中的模糊影响。然后作者使用了infomap算法来对组水平的所有胎儿的功能数据进行分割，以使用有效的子网络。
社区检测方法从197个功能定义区域的矩阵中产生了一个16功能网络的组水平模型。富集分析被用来评估网络内连接和网络间连接与NAS因子之间的相关性是否显著的出现在特定的网络内或网络间的关联上，使用置换检验，重复10000次来保证结果的有效性。结果显示了六个网络对与母亲产前NAS有关的连接性差异（A-F）。图中展示了网络内和网络间富集显著的ROI-ROI静息态功能连接（RSFC）。
探索性和确认性因素分析产生来一个单一的多指标因子，被用来评估产妇产前负性情绪/压力（NAS）。作者通过回归孕周这个变量来控制NAS中与孕周相关的方差变异，使用回归后的残差来计算后续所有分析。富集分析是通过以下方法实现的：首先对组水平的ROI连接矩阵做了阈值化，只有p值小于0.05的连边才进入后续的分析中。然后开始计算每一条连边与胎儿的母亲的NAS（压力）之间的相关性，在获得这个相关性后，作者使用了fisher精确值检验来检验这些连边中能够在组水平的网络分割中网络内配对下显著富集和网络间配对下显著富集的概率。作者使用了基于蒙特卡洛方法的置换检验来抽样10000次检验原假设的真实性。为了探索母体NAS评分和胎儿大脑连接性之间的关系是否受到社会支持或适应性健康行为的影响，我们首先使用探索性因素分析来减少社会环境和健康行为的10个测量维度。用实际和重新采样的数据进行碎石图分析以及Bartlett球度检验都说明，这些变量可以最好地概括为三个因素，一个与健康有关（"健康参与"；HE），一个与家庭冲突/凝聚力有关（"家庭系统"；FS），第三个是睡眠、医疗坚持、药物使用和ECR-R人际回避的混合物（"健康与成人关系"；HAR）（图S2）。接下来，为了进一步降低维度，我们采用了基于混合物的建模策略，即加权量化和（WQS）回归，构建了一个根据经验估计的单一连接性指数（即WQS压力连接性指数），总结了RSFC在特定胎儿大脑中的总体影响程度。第三步，构建初步的单变量模型，评估WQS压力连接性指数与母亲NAS得分之间的关系，而不考虑额外的健康和社会支持因素。最后，重新运行模型，加入健康和社会支持因素，以检查效果修正和交互作用。在所有模型中，采用了稳健的交叉验证策略，如将数据分为训练（40%的数据）和验证（60%）集，在应用于验证集之前，先在训练集中估计模型权重，以避免过度拟合并确保结果的普遍性。
图S2 社会支持与适应性健康行为的因子结构
我们还评估了母亲产前NAS、胎儿大脑和分娩年龄之间的关系。使用标准的线性模型来评估这些关系，使用如上所述的母亲压力、个体网络间连接值或压力-连接性WQS混合物作为预测因素。使用InfoMap方法在组水平获得了一个由16个功能子网络构成的组水平网络模型（图2），成为提取母亲产前NAS与网络间和网络内RSFC之间的重要关系的基础。作者使用了延伸的富集分析来研究网络内、网络间连接和母亲NAS之间的关系。研究结果表明，母亲产前NAS的影响在六个胎儿网络中是显著的。具体来说，母亲产前NAS因素得分与(i)上额和感觉运动网络(SFG-SMA)、(ii)左后脑岛/颞顶交界处和右上顶网络(pINS/TPJ-PAR)、(iii)上额和顶叶连接网络(SFG-PAR)以及(iv)前额和顶叶连接网络(PFC-PAR)之间FC值的变化有关。此外，母亲产前NAS评分与(v)皮质下纹状体网络(SC-SC)和(vi)额叶上回网络(SFG-SFG)中的FC有关。显著的网络间和网络内效应用χ2检验确认了其独立性。表1提供了包含显著富集结果的连接总结，图3直观地显示了网络间的正负显著连接。
每个网络内的显著连接数因区域不同而不同。富集c2统计量和p值描述了每个网络对中显著ROI-ROI对的数量在多大程度上大于偶然情况。
图3 胎儿大脑大尺度网络间和网络内的RSFC与代表累积的母亲产前负性情绪和压力因素（NASF）变化的因子是双向联系的。在NASF较高的母亲的胎儿中较强的连接用红色表示，反之则用蓝色表示。箱型图表示顶部和底部NASF四分位数的全局平均中心r值，在每个网络对内的正或负网络边上做了平均。我们在混合模型中进一步评估了胎儿连接性和母体压力之间的关系。加权量化和（WQS）模型重复了富集分析和χ2检验的结果，显示NAS和6个网络的连接性作为一个混合物是显著存在的（β = 0.82，P < 0.001），并强调最强的关联是SFG-SMA、pINS/TPJ-PC和SFG-PAR网络对的连接性（图S3）。接下来，我们通过检查包括健康和社会支持因素的WQS模型中的潜在相互作用来测试调节效应。我们发现NAS与对应于饮食、运动（因子HE）和家庭冲突/凝聚力（因子FS）的因子之间没有明显的关联，但发现由睡眠、医疗依从性、物质回避和低人际回避（因子HAR）组成的因子，明显调节了母亲产前NAS和WQS压力-连接性指数之间的关系（β = 0.16，P = 0.02）。这种影响是HAR得分较低的参与者与压力-连接性指数的关系较弱，但总体上压力较高。在这种相互作用的背景下，PFC-PAR和SFG-SMA网络之间的连接性与HAR有最显著的关系（P < 0.000；表S4）。
图S3 WQS权重描述了每个重要网络对WQS压力-连接性指数的贡献。WQS模型复制了富集分析和χ2检验的结果，显示NAS和6个网络的连接性作为一个混合物是显著的（β=0.82，P<0.001），并强调最强的关联是SFG-SMA、pINS/TPJ-PC和SFG-PAR网络对的连接。
表S4 孕产妇健康/社会情绪支持措施、NAS和重要网络对的RSFC之间的联系
母体NAS得分与分娩时的胎龄有关（β=-0.36，p=0.003），与之前的文献一致。在此，我们扩展了对压力连接指数的分析，以考虑胎儿大脑中的压力相关因素与胎儿出生时的胎龄之间的潜在关联。我们的研究结果表明，综合WQS压力连接指数与分娩时的胎龄之间有轻微的显著负相关（β=-0.18，P=0.05）。也就是说，反映压力对每个胎儿神经连通性影响的单一指标与该胎儿的出生时间有关（见图4）。鉴于这种关系的显著性处于边缘水平，我们用传统的线性模型进行了后续分析，以调查每个网络对中NAS和妊娠期长度之间的关联。应用Holm-Bonferroni校正对出生时胎龄的连接性进行六次测试，我们观察到分娩时胎龄与SFG-PAR（β=-2.46，p=0.008）、pINS/TPJ-PAR（β=-2.68，p=0.007）和SFG-SMA（β=-3.52，p=0.016）网络对之间的显著关联（表2）。
图4 母体压力对胎儿大脑的影响与分娩时的胎龄有关。左图描述了WQS压力连接性指数与分娩时胎龄之间的负相关（β=-0.18，p=0.05）。因此，与压力相关的胎儿连接性变化与较短的妊娠期有显著相关。右图描述了6个重要网络对中每个受试者与母亲压力显著相关的网络连边的平均连接强度（FC（z））。在SFG-PAR（β=-2.46，p=0.008）、pINS/TPJ-PAR（β=-2.68，p=0.007）和SFG-SMA（β=-3.52，p=0.016）网络对中，观察到压力-连接性效应的强度与分娩时的胎龄有明显的关联。
母亲的人口统计学、数据质量控制（QC）参数和富集分析中使用的母亲NAS残差之间的关联测试基本上不显著，这表明有可能这些随机因素似乎没有影响到在这个数据集中进行的分析。母亲NAS残留分数与母亲年龄（r=0.018，p=.85）、总收入（r=-0.061，p=0.55）、胎儿图像的平均平动（r=-0.109，p=0.24）或图像帧数（r=0.123，p=0.18）没有关系。然而，产妇的NAS残留分数与平均转动有显著关系（r=-0.185，p=0.045）。因此，我们进行了额外的分析，测试头动与各受试者之间显著的网络连接效应之间的关系。大多数网络对的连接值与头动无关，但观察到转动与SFG-SMA连接之间有相关性(r=-0.24, p=0.009)。这种相关性没有过Bonferroni校正。作为一个额外的步骤，我们确认了头动和整个WQS连接性指数没有明显的关系，WQS和平动运动，r=0.008，p=.951，WQS和转动运动，r=-0.165，p=.203。在我们的分析中感兴趣的其他背景变量，特别是社会支持和健康行为，确实与产妇NAS有预期的关系：NAS得分与产前ECR-R避免（r=-0.46，p<0.001）、饮食（r=-0.23，p=0.016）、医疗坚持（r=-0.29，p=0.001）和睡眠（r=-0.34，p<0.001）呈负相关，与药物滥用呈正相关（r=0.41，p<0.001）。母亲NAS与其他社会支持和健康行为分量表没有关系，包括ECR-R焦虑、FES-R凝聚力、FES-R表现力、FESR冲突、运动。从健康和疾病的发展起源（DOHaD）的角度来看，这项研究提供了一个框架来评估在社会和行为背景下生物风险的早期嵌入。对新生儿和幼儿的研究表明，产前压力荷尔蒙作用于各种信号受体，与遗传/表观遗传因素和额外的环境输入相互作用，影响出生前的大脑发育。生命早期压力的动物模型支持了这一观点，证据表明，在生命的头几周（相当于人类的第三个月）受到压力的小鼠幼崽显示出较短和复杂性较低的树突，髓鞘化不足，以及突触发生的改变。然而，神经发育的轨迹是否在子宫内就开始改变，仍然是人类产前压力编码领域的一个长期问题。本研究提供证据表明，母亲产前压力和负面情绪与出生前人类大脑网络的改变有关。本文报告了胎儿大脑在系统水平上的脑功能连接和母亲产前压力和负性情绪之间的关系，从而扩展了压力的生物嵌入模型，把我们推回到人类大脑成熟的最微妙的时期，因为那段时期的变化比生命过程中的任何其他时间都更快。胎儿功能连接的改变在上额区和运动区之间以及后脑岛和颞顶脑区的跨半球连接（pINS/TPJ-PAR）。这些观察结果是有意义的，鉴于这些区域之间的连接性随着胎龄的增长而增加，而且这些区域的异常连接在胎儿和早产新生儿中也有报道。这些研究证实了这些区域之间的连接过程在胎儿期的重要性，并暗示这些过程的变化可能有长期的影响。本文一个重要的结果是，在子宫内暴露于更大压力的胎儿中，前额和后额及顶叶区域之间的RSFC（SFG-PAR；PFC-PAR）和额上回内的连接（SFG-SFG）存在明显差异。对新生儿和婴儿的研究证实，这些网络在人类生命早期就很明显，对成年人的研究表明，额叶网络连接的中断在人类情感、精神和神经系统疾病中可能具有跨诊断作用。此外，在包括纹状体区域的胎儿亚网络中观察到与母亲产前压力相关的RSFC差异。压力对纹状体的影响已被证明与神经元的微观结构、基因和神经化学表达以及连接性有关。对人类和动物的研究证实，压力后纹状体的重组与行为有关，对社会行为、决策、情感评价和内化疾病风险等领域影响最大。总的来说，本研究的数据表明，胎儿大脑的广泛差异与孕期母亲自我报告的压力和负面情绪有关。这些研究结果推进了先前的人类研究，这些研究证明了压力的心理和生物指数的前瞻性测量与大脑结构和功能之间的关联。这里提出的经验性证据，以及之前有影响力的研究中的数据，都支持这样的观点：胎儿在子宫内的过度压力有可能影响神经发育，对未来整个生命周期的健康有影响。
