病毒滴度的测定

稀释计数法

滴度单位：TU/ml，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。”TU”为”transducing units”的缩写，中文为“转导单位”，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。

第一天 细胞准备

将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1×105/ml，加入96孔板，100µl/孔，为每个病毒准备10个孔。放入37℃，5%CO2培养箱中培养。

第二天 加病毒

在EP管中做10倍梯度稀释，连续10个稀释度。稀释方法如下：每种病毒准备10个1.5ml EP管，每管加入90µl培养液，往第一个管中加入10µl病毒原液，混匀后，吸取10µl加入第二个管混匀。依此类推，做十个稀释度（10~10-8）。

吸取96孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。并做好标记。

第三天 追加培养液

在每个孔再加入100µl完全培养液，利于细胞的生长。

第五天 观察结果并计算滴度

在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。假设为X和Y，则滴度（TU/ml）=（X+Y×10）×1000/2/X孔的病毒液的含量（µl ）。

定量PCR法

病毒感染1天前，取6孔板接种HOS细胞。每孔细胞为5×104个。

接种细胞24小时后，取两个孔的细胞用血球计数板计数，确定感染时细胞的实际数目，记为N。

弃去其他培养板中的培养基，更换为含有5μg/ml polybrene的新鲜培养基。将浓缩病毒用培养基稀释200倍，也就是取1μl病毒加入到199μl的培养基中。在3个培养孔中分别加入0.5μl，5μl和50μl的稀释病毒。

感染开始后20小时，除去培养上清，换为500μl含DNaseI 的新鲜培养基。在37℃消化15分钟，这一步是要除去残余的质粒DNA。然后换为2ml正常的培养基，继续培养48小时。

用0.5ml 0.25%胰酶-EDTA溶液消化细胞，在37℃放置1分钟。用培养基吹洗下，离心收集细胞。按照DNeasy试剂盒的说明抽提基因组DNA。每个样品管中加入200μl洗脱液洗下DNA。用DNA定量试剂盒定量（Bio-Rad）。基因组DNA可以稳定保存在-20℃至少2个月。

准备PCR所需的试剂和样品。为病毒序列检测引物配总管Ⅰ：

Forward primer (100 pmol ml-1)	0.1μl × n
Reverse primer (100 pmol ml-1)	0.1μl × n
Probe (100 pmol ml-1)	0.1μl × n
H2O	19.7μl × n

n = number of reactions。例如：总反应数为40，将1ml 2× TaqMan Universal PCR Master Mix，4μl forward primer，4μl reverse primer，4μl probe 和788μl H2O混和。震荡后放在冰上。

2× TaqMan Master Mix	25 μl × n
10×RNaseP primer/probe mix	2.5 μl × n
H2O	17.5μl × n

n = number of reactions。例如：总反应数为40，将1ml 2× TaqMan Universal PCR Master Mix，100μl 10×RNaseP primer/probe mix和700μl H2O混和。震荡后放在冰上。

在预冷的96孔PCR板上完成PCR体系建立。从总管Ⅰ中各取45μl加入到A-D各行的孔中，从总管Ⅱ中各取45μl加入到E-G各行的孔中。

分别取5μl质粒标准品和待测样品基因组DNA加入到A-D行中，每个样品重复1次。另留1个孔加入5μl的水做为无模板对照（no-template control）。

分别取5μl基因组标准品和待测样品基因组DNA加入到E-G行中，每个样品重复1次。另留1个孔加入5μl的水做为无模板对照（no-template control）。

所使用定量PCR仪为ABI PRISM 7000定量系统。循环条件设定为：50℃ 2分钟，95℃10分钟，然后是95℃15秒，60℃1分钟的40个循环。

数据分析：测得的DNA样品中整合的慢病毒载体拷贝数用基因组数加以标定，得到每基因组整合的病毒拷贝数。

滴度（integration units per ml，IU ml-1）的计算公式如下：
IU ml-1= (C ×N× D×1000)/V

其中：C = 平均每基因组整合的病毒拷贝数；N = 感染时细胞的数目（约为1×105）D = 病毒载体的稀释倍数 ；V = 加入的稀释病毒的体积数。