科研| MOL CANCER：m6A依赖性糖酵解促进结直肠癌发展（国人佳作）
编译：阿温，编辑：谢衣、江舜尧。
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表观遗传学的改变涉及结肠直肠癌（CRC）发生发展的各个方面。RNA甲基化修饰是一种新的表观遗传学调控方式。N6-甲基腺嘌呤（m6A）是真核生物中mRNA最丰富的化学修饰，是调节mRNA稳定性、剪切和翻译的关键。m6A调节基因的改变在多种人类疾病的发病机制中起着重要作用。本文针对m6A修饰是否参与CRC葡萄糖代谢进行深入研究。首先在CRC患者中观察到METTL3与18F-FDG摄取之间存在明显相关性。在多种CRC模型中，METTL3诱导的CRC肿瘤发生依赖于细胞糖酵解。其次，METTL3可以直接与HK2的5'/3'UTR区域及SLC2A1的3'UTR区域（GLUT1）发生相互作用，进一步稳定这两个基因并激活糖酵解途径。再者，m6A介导HK2和SLC2A1（GLUT1）的稳定性分别依赖于m6A阅读器IGF2BP2和IGF2BP2/3。所以，METTL3是CRC的功能性致癌基因，METTL3通过m6A-IGF2BP2/3机制而稳定CRC中HK2和SLC2A1 (GLUT1)的表达。靶向METTL3及其所在通路为高糖代谢的CRC患者提供了合理的治疗靶点。
论文ID
原名：m6A-dependent glycolysis enhances colorectal cancer progression
译名：m6A依赖性糖酵解促进结直肠癌发展
期刊：Molecular Cancer
IF：10.679
发表时间：2020.4
通讯作者：洪洁
通讯作者单位：上海交通大学医学院附属仁济医院
实验设计
实验结果
1. METTL3与CRC糖酵解密切相关
为了探讨m6A修饰与CRC糖酵解代谢的相关性，利用实时定量PCR分析接受18F-FDG PET扫描的CRC患者中m6A基因表达情况，发现FDG摄取与METTL3表达的相关性最显著(图1a-b)。GEO数据库(GSE110225)分析也表明CRC患者中FDG摄取与METTL3表达存在显著相关性(图1c)。另外，FDG摄取与METTL3免疫组化染色显著相关(图1d-e)。LC-MS/MS(图1f)和m6A斑点印迹(图1g)实验显示，摄取FDG越多的CRC患者，其m6A水平越高。利用RNA测序及GSEA分析发现糖酵解途径和CRC癌变过程与METTL3敲除呈负相关(图1h)。此外，在HCT116野生型和METTL3基因敲除细胞中进行高通量质谱代谢组学分析，发现敲除METTL3显著降低HCT116细胞中葡萄糖-6-磷酸、丙酮酸和乳酸等糖酵解途径中关键成分的水平(图1i)。这些数据表明，METTL3可能影响CRC的糖酵解代谢和CRC癌变。
2. METTL3促进CRC中糖酵解代谢
敲除METTL3或者干扰METTL3后，HCT116细胞的乳酸产量(糖酵解的关键代谢物)和葡萄糖摄取均显著下降(图2a-d)。通过测定CRC细胞的细胞外酸化率(ECAR)和耗氧量(OCR)来确定METTL3的改变是否直接影响糖酵解，结果显示HCT116细胞敲除或干扰METTL3后显著降低ECAR水平(图2e-f)，但对OCR水平无明显影响。
为了阐明METTL3诱导的CRC糖酵解是否依赖于其甲基转移酶功能，于是构建了METTL3野生型(pcDNA3.1-METTL3)和突变型(pcDNA3.1-METTL3-mut，甲基转移酶结构域突变)重组质粒。DLD1细胞中过表达METTL3显著增加了乳酸产量、葡萄糖吸收和ECAR水平，然而METTL3突变后阻断了CRC细胞中METTL3诱导的糖酵解(图2g-i)。为了进一步探索METTL3对糖酵解的影响，利用18F-FDG PET测定小鼠体内葡萄糖摄取量，数据显示敲除METTL3可降低移植瘤小鼠模型的葡萄糖摄取(图2j)。另外，过表达METTL3质粒，而不是METTL3突变体，可以显著增加小鼠体内葡萄糖摄取(图2k)。这些数据表明METTL3通过其甲基转移酶结构域调控CRC糖酵解。
3. METTL3诱导CRC增殖依赖于糖酵解的激活
已有研究证明METTL3是肿瘤发生的关键调节因子，然而与METTL3在CRC中的作用是相矛盾的。功能实验显示敲除METTL3后抑制HCT116细胞的增殖(图3a)和克隆形成(图3b)。在小鼠移植瘤模型中，敲除METTL3显著降低了HCT116的肿瘤生长(图3c-d)和肿瘤重量(图3e)。
在DLD1细胞中过表达METTL3可以增强细胞的增殖能力(图3f)和克隆形成能力(图3g)，并且在小鼠移植瘤模型中，过表达METTL3可以显著增加DLD1的肿瘤生长(图3h-i)和肿瘤重量(图3j)。然而METTL3突变体过表达后，在体内外均未观察到同样的现象。2-DG（糖酵解途径抑制剂）在体内外均明显抑制METTL3诱导的细胞增殖及克隆形成(图3k-o)。这些数据说明METTL3可能是一种肿瘤驱动基因，并通过调节CRC的糖代谢而促进CRC发展。
4. m6A-seq和RNA-seq分析确定在CRC中METTL3的潜在靶点
选择HCT116野生型细胞和敲除METTL3细胞进行转录组m6A-seq和RNA-seq测序。利用m6A斑点印迹法、m6A定量法及LC-MS/MS分析，发现与野生型细胞相比，METTL3敲除细胞中m6A水平明显下降(图4a-c)。在m6A中最常见的'GGAC’基序被显著富集(图4d)。大多数METTL3结合位点(>80%)位于蛋白CDS区域，在5'UTR和3'UTR高度富集，特别是在终止密码子附近富集，这与m6A分布一致(图4e)。m6A-seq分析显示，HCT116细胞敲除METTL3后，在转录水平上m6A呈低甲基化(图4f-g)。通过对RNA-seq数据的分析，在敲除METTL3细胞中鉴定了429个mRNA转录水平下调的m6A低甲基化基因和595个mRNA转录水平上调的m6A低甲基化基因(图4h)。鉴于METTL3在m6A甲基转移酶复合物中的作用，在METTL3敲除的HCT116细胞中包含m6A低甲基化的mRNA转录的基因可能是潜在的靶点。m6A低甲基化的基因在METTL3敲除的CRC细胞中表达降低，其中18个基因(PYGB, FUT1, GALNS, HK2, IDUA, PC，ENO3, SGSH, ST3GAL2, SLC2A1, HS6ST1, HS3ST1，SLC26A1、NUP62、GLCE、CHST12、ADOGK和AGRN)参与碳水化合物代谢和葡萄糖代谢，被筛选为潜在的靶基因(图4i)。根据MeRIP-seq数据，在METTL3敲除的HCT116细胞中，6个基因的m6A峰均显著降低(图4j)。MeRIP-PCR数据验证与MeRIP-seq数据一致(图4k)。进一步MeRIP-qPCR分析显示，在METTL3敲除的HCT116细胞中，6个靶基因中5个的m6A水平被显著降低(图4l)。CRC患者的MeRIP-seq数据与CRC细胞系的数据一致。因此，我们选择HK2和SLC2A1 (GLUT1)作为METTL3的候选靶点进行下一步的研究。
5. METTL3调节HK2和SLC2A1 (GLUT1) 的mRNA水平和稳定性，且与m6A甲基转移酶活性相关
敲除或干扰METTL3细胞中，HK2和SLC2A1 (GLUT1)表达被下调(图5a-b)。过表达METTL3后HK2和SLC2A1 (GLUT1)表达量显著升高，然而过表达METTL3突变体未有此现象(图5c)。另外，研究发现敲除或干扰METTL3后，己糖激酶活性明显降低(图5d-e)。相反，过表达METTL3后，己糖激酶活性显著升高，但METTL3突变体不会改变(图5f)。为探讨m6A修饰对HK2及SLC2A1 (GLUT1)基因的影响，将METTL3 siRNA构建于带有完整m6A序列的野生型HK2基因5'和3'UTR中以及野生型SLC2A1 (GLUT1)基因3'UTR中，它显著降低单个报告基因的荧光素酶活性，然而METTL3的下调对HCT116中m6A位点突变的报告基因的荧光素酶活性没有显著影响；相反，过表达METTL3而非METTL3突变体可以显著增强荧光素酶活性，并且过表达METTL3和METTL3突变体对m6A位点突变的报告基因的荧光素酶活性无明显影响(图5g-i)。
为了分析m6A修饰对METTL3靶基因转录稳定性的影响，进行了RNA稳定性检测，结果显示干扰METTL3后降低了HCT116细胞中HK2和SLC2A1 (GLUT1) mRNA的半衰期(图5j-k)。因此，METTL3诱导HK2和SLC2A1 (GLUT1)上调，有部分原因是由于HK2和SLC2A1 mRNA转录的稳定性增加。胰岛素样生长因子2(IGF2) mRNA结合蛋白(IGF2BP1, IGF2BP2, IGF2BP3)是哺乳动物细胞中三个公认的m6A受体。HCT116细胞中，干扰IGF2BP2后HK2 mRNA半衰期明显缩短(图5l)，而当IGF2BP2/3表达下调后SLC2A1 (GLUT1) mRNA表达降低(图5m-n)。RIP实验显示IGF2BP2直接与HK2 mRNA的5'UTR和3'UTR结合，IGF2BP2/3直接与SLC2A1 (GLUT1) mRNA的3'UTR结合(图5o)。RIP实时定量PCR检测表明，敲除METTL3明显降低IGF2BP2与HK2 mRNA 5'/3'UTR的结合效率，也降低IGF2BP2/3与SLC2A1 (GLUT1) mRNA 3'UTR的结合效率(图5p)。综上所述，METTL3介导的m6A修饰分别通过IGF2BP2和IGF2BP2/3的mRNA稳定性调节而增加HK2和SLC2A1 (GLUT1)的表达。
6. HK2和SLC2A1 (GLUT1)是CRC中METTL3发挥功能的重要靶基因
采用rescue实验探讨HK2和SLC2A1 (GLUT1)是否参与CRC中METTL3的生物学功能。HK2或SLC2A1的异位表达部分恢复了METTL3敲除细胞的增殖(图6a)和克隆形成能力(图6b)以及体内肿瘤的生长(图6c-e)。在糖酵解测定中，HK2或SLC2A1 (GLUT1)的异位表达恢复了敲除METTL3细胞中乳酸产量的下降(图6f)。同时，在体内外过表达SLC2A1 (GLUT1)可以恢复敲除METTL3细胞中摄取葡萄糖的下降水平(图6g-h)。HK2或SLC2A1 (GLUT1)的下调降低了METTL3诱导的高乳酸盐的产生(图6i)。SLC2A1(GLUT1)的下调明显减弱体内外METTL3诱导的高糖摄取(图6j)。因此，HK2和SLC2A1 (GLUT1)介导CRC细胞中METLL3的调节功能。
7. METTL3表达水平和糖酵解密切相关并在CRC患者中具有临床相关性
免疫组化实验中，METTL3表达高的样品对HK2和GLUT1染色较强，相反，METTL3表达低的样品中HK2和GLUT1的含量较低(图7a)。CRC组织中METTL3的表达与HK2、GLUT1的表达呈正相关(图7 b)。METTL3表达升高时HK2或GLUT1预测到较短的无病间隔(图7c-h)。在CRC中，METTL3、HK2和GLUT1的联合表达与治疗后的复发风险呈线性相关(图7i)。含这三种标记物高表达的患者无病生存期最短(图7j)。所以METTL3及其靶基因表达水平的升高可能是CRC患者预后不良的标志。
METTL3可能通过稳定CRC细胞中的HK2和SLC2A1 mRNA水平而发挥致癌基因的功能。近年来，多种RNA甲基转移酶抑制剂被开发成为抗肿瘤候选药物。HCT116细胞展现较高的METTL3表达水平，利用m6A抑制剂DAA进行治疗，结果显示DAA治疗组中细胞增殖抑制率为39%；相反，在METTL3表达量较低的DLD1细胞中，用同样剂量DDA处理细胞仅能抑制20%的细胞增殖(图7k)。在裸鼠移植瘤实验中，DAA对HCT116细胞移植瘤生长和重量的抑制作用强于DLD1细胞的(图7l-n)。综上所述，与METTL3表达较低的CRC细胞相比，METTL3表达较高的CRC细胞中靶向METTL3治疗可能更有效。本文研究的总结性示意图如图7o所示。
讨论
本文首次发现在结直肠癌患者组织中m6A修饰与糖酵解途径的激活密切相关。在结直肠癌中，HK2和GLUT1被m6A调节并参与糖酵解的激活。METTL3➔HK2 / GLUT1-IGF2BPs可能在结直肠癌的发病机制中起着至关重要的作用。靶向METTL3及其通路可能是治疗高糖代谢结直肠癌的有效途径。
原文网址：https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-020-01190-w