「柳叶刀全文」Ad5-nCoV的安全性、可耐受及免疫原性
整体看下来，看到了希望，但更多的还是挑战：
https://www.thelancet.com/lancet/article/s0140673620312083
背景：亟需疫苗来保护免于COVID-19感染。本研究只在评估用对人无害的腺病毒5型作为载体表达SARS-CoV2的Spike蛋白作为疫苗（Ad5-nCoV）的的安全性、可耐受性及免疫原性。
方法：在武汉开展了一项Ad5-nCoV疫苗的剂量递增的、单中心、开放标签的、非随机的Ph1研究，入组了18-60岁的健康受试者，并分配至5 × 10¹⁰、1 × 10¹¹和1·5 × 10¹¹vp三个剂量组接受肌肉注射疫苗。主要终点是接种后7日内的不良事件。会对接种后28天的安全性进行评估。免疫原性方面：对特异性抗体进行ELISA检测，并用SARS-CoV2和假病毒中和试验来检测免疫诱导的中和抗体应答。同时用酶联免疫斑点试验和流式细胞来检测T细胞应答。临床登记号：NCT04313127（https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04313127）
结果：
20年3月16日至27日，筛选了195名受试者，最终入组108例：51%为男性，中位年龄36.3，分配制低中高剂量组各36人。所有入组的患者被纳入分析：在免疫后的前7日内，低中高剂量组分别30(83%)、30(83%)和27(75%)例患者报道有AE。
最常见的注射位置不良事件是疼痛，在58(54%)例受试者中报道；而报道最常见的全身不良事件有发热(50[46%])、疲劳(47[44%])、头疼(42[39%])及肌痛(18[17%])。所有剂量组中报道的不良事件都是轻度和中度，接种后28日内没有报道严重不良事件。
接种后14日ELISA抗体及中和抗体明显升高并在接种后第28日到达峰值。而特异性的T细胞应答在接种后第14日也达到峰值。
说明：
Ad5-nCoV疫苗接种后28日可耐受并具免疫原性。接种后的第28日体液免疫达到峰值，而特异性的T细胞应答在接种后第14天也达到峰值。这些发现支持Ad5-nCoV疫苗的进一步研究。
正文
背景介绍
目前针对疫情防控还是主要靠隔离，所以亟需疫苗来降低SARS-CoV-2引起的发表与死亡相关的负担。目前全球有百余款候选疫苗处于开发阶段，其中至少8款已经或者即将进入临床试验阶段。其中Moderna的mRNA-1273和CanSino的Ad5-nCoV均于3月6日进入Ph1，Inovio的DNA疫苗也于4月3日进入Ph1。另外4月份Sinovac、武汉生物制品所和北京生物制品所均各有一款COVID-19灭活疫苗进入Ph1。而牛津大学的ChAdOx1 nCoV-19和BioNech的mRNA疫苗也很快启动临床。
这里报道了中国健康受试者接种Ad5-nCoV后28日的安全性、可耐受性及免疫原性的初步结果。
方法
试验设计与受试者
研究者在武汉开展了一项Ad5-nCoV疫苗的单中心、开放标签、非随机、剂量递增的Ph1研究。入组的受试者要求18-60岁的健康人，且经咽拭子或痰液及肛拭子的核酸检测及血清特异性Ig M及Ig G检测未被SARS-CoV-2感染，并经CT确认肺部无病灶。排除标准包括：癫痫或精神病史、对疫苗在内的成分过敏、急性发热、近4个月内接受过任何的血制品治疗、近4个月内接种过任何的疫苗、无法完成研究规划。
受试者随后依次分配至剂量递增的3个组，均接受单剂的肌注接种：低剂量组受试者接种完成后至少随访3日才招募中剂量组接种后观察3日的安全性，最后招募接种高剂量的疫苗。一旦触及剂量递增的终止标准就终止接种高剂量和新入组。
研究步骤
疫苗由军科院北京生物技术研究所及CanSino共同开发，以复制缺陷的5型腺病毒为载体表达SARS-CoV2的S蛋白。研究者基于Wuhan-hu-1克隆了优化的全长spike基因并与组织纤溶酶原激活蛋白信号肽基因一起插入提出抗议E1和E3的Ad5载体构建COVID-19疫苗。随后d5-nCoV疫苗按照5 × 10¹⁰/0.5mL生产液体配方。
然后低中高剂量组分别5 × 10¹⁰、10 × 10¹⁰和15 × 10¹⁰进行单次肌注接种。
接种后前14日内不良时间由受试者自己记录但每日需由由PI确认。接下来几周由受试者每日登记在记录卡上。接种后第7日的实验室安全性检查包括白血球计数、淋巴细胞计数、中性粒细胞计数、血小板计数、血红蛋白、ALT、AST、胆红素、空腹血糖和肌酐来评估接种后的毒性。根据19版NMPA的标准对实验室检查的AE和异常改变进行分级。
分别于接种前、接种后第7及14日采集血液样本进行血清检测。通过ELISA检测对RBD及S蛋白的抗体应答，1:40的稀释作为阳性界定值。同时用获得SARS-CoV-2及表达S蛋白的假病毒来检测疫苗诱导的中和抗体。分别于接种前、接种后第7及14日从外周血分离单核细胞，特异性T细胞应答：即检测前12-24小时用S蛋白的肽库刺激新鲜的外周血单核细胞，酶联免疫斑点试验检测来定量INFγ，最终计算每10万个细胞中斑点形成细胞的数量。一旦接种后分泌INFγ的T细胞数量升高2倍就被认定为阳性。通过INFγ、IL-2和TNFα的分泌来评估CD4+和CD8+ T细胞应答：S蛋白肽库刺激单核细胞6hrs后进行胞内细胞因子染色并用流式探测。同样的方法检测T细胞应答。另外用血清中和试验来检测anti-Ad5的中和抗体滴度。
研究终点
研究者分析了ITT队列的全部结果。主要终点安全性是接种后7日内的不良反应发生率。而主要安全性终点是接种后7天实验室检测的任何异常及接种后28天所有分组的不良事件。对RBD及S蛋白的特异性ELISA抗体滴度作为体面免疫原性终点。定义接种后滴度相比基线提升至少4倍为抗体应答阳性（血清学转化）。细胞应答终点包括ELISpot 检测INFγ及胞内细胞因子染色检测阳性的T细胞应答。基于受试者事先存在的Ad5中和抗体滴度【低or阴性(≤1:200) vs高(>1:200)】对免疫应答进行分层分析。
结果
2020年3月16日至27日，研究者筛选了195例健康受试者，从中依次招募并分别接受低中高3个剂量的Ad5-nCoV，所有受试者完成接种和28天的观察。
基线特征如下表所示，三个剂量组基本平衡：
81%（87/108）的受试者在接种后7日内报道至少经历1次不良事件：低剂量组83%（30/36）、中剂量组83%（30/36）、高剂量组75%（27/36），三组间整体上没有差异。最常见的注射位点不良事件是疼痛，在54%（58/108）的受试者中有报道：其中低剂量组47%、中剂量组56%、高剂量组58%。最常见的全身不良事件包括：发热 (50 [46%])、疲劳(47 [44%])、头痛(42 [39%])和肌肉疼痛(18 [17%])。其中，低中高剂量组分别42%、42%和56%的受试者报道有发热；分别39%、31%和47%的受试者报道头痛；分别19%、8%和22%的受试者报道肌肉疼痛。
多数的不良事件是轻度或者中度。共9例受试者报道有≥Gr3 的严重发热（超过38.5℃）：低中高剂量组分别2、2和5例，其中高剂量组有1例是严重发热伴随严重的疲劳、呼吸困难和肌肉疼痛症状，另外高剂量组还有1例患者报道严重的发热和关节疼痛。这些症状一般在接种后24hrs给出现但一般U会持续超过48hrs。另外在不同剂量组之间不良反应及整体不良事件发生率没有差异。
体内预先Ad5中和抗体滴度（＞1：200 vs ≤1：200）越高，接种后发热的发生率显著降低(odds ratio 0·3, 95% CI 0·1–0·6)。
接种后28日没有报道严重不良事件。接种后第7天，8%(9/108)的受试者报道有轻度或中度的胆红素升高，9%(10/108)的受试者ALT升高，4%(4/108)的受试者空腹血糖升高，但是没有任何得到临床确诊。
三个剂量组的受试者在第14天都观察到了对RBD的结合抗体应答。在第28天的时候，高剂量组有着更高的GMT 1445.8，而中剂量组和低剂量组分别806.0和615.8。高中低剂量组中分别100%、94%和97%的受试者中观察到anti-RBD抗体的至少4倍提升。中和抗体在接种当日（Day0）都是0，到了接种后第14天稳步提升，最终在第28天达到峰值。高剂量组中和抗体GMT 34.0明显高于中低剂量组的16.2和14.5，高剂量组与中、低剂量组的ED分别27.7和32.2。同时在第28天的时候，高中低剂量组中分别75%、50%和50%的受试者中观察到中和抗体滴度的至少4倍提升。
S蛋白的结合抗体及假病毒的中和抗体应答也是类似：
抗体应答峰值（第28天）时，ELISA检测中抗体结合RBD及中和抗体结合病毒呈现了中度的正相关（0.753），而用假病毒测量的中和抗体滴度同样也和SARS-CoV-2检测的相一致。
接种前，低中高剂量组各20(56%)、19(53%)和16(44%)名受试者体内存在高滴度的Ad5中和抗体（＞1：200）。在低剂量组的20名体内原先存在高滴度Ad5中和抗体的受试者中，只有5(25%)名在接种后28天时中和抗体的滴度升高至少4倍，而这一数字在中高剂量组分别37%(7/19)和63%(10/16)。
多变量分析显示，不论剂量如何，预先存在Ad5中和抗体的高滴度让接种后中和抗体血清学转化效果有所打折，另外45-60岁的接种者相比年轻的接种者有着更低的中和抗体血清学转换。
假病毒检测的中和抗体滴度也和用SARS-CoV-2检测的一致：
由于斑点形成细胞低于检测范围下限，基线状态的ELISpot反应不可测，但是在接种后14天达到峰值。各个剂量组应答阳性的比例83-97%，低中高剂量组中每10万个细胞中斑点形成细胞的中位值分别20.8(95%CI 12.7-34.0)、40.8(95%CI 27.6-60.3)和58.0(95%CI 39.1-85.9)。高剂量组的T细胞应答显著高于低剂量组(p<0.0010)，但是和中剂量组相比差异并不显著。到了第28天的时候，各个剂量组的T细胞应答有轻微下降。
基线高水平的Ad5中和抗体滴度降低了所有剂量组尤其是低剂量组在接种后的T细胞应答峰值。尽管预先存在的Ad5高免疫有所影响，但中低高剂量组的预先存在高水平Ad5免疫的受试者在接种后第14天分别75%(15/20)、95%(18/19)和94%(15/16)被确认为阳性应答者，而到了第28天这一比例分别为60%(12/20)、84%(17/19)和100%(16/16)。
接种后第14和28天全部受试者都从CD4+及CD8+ T细胞检测到INFγ。
接种后第14天低剂量组的CD4+ T细胞中表达的TNFα显著低于高剂量组(P<0.001)和中剂量组(p=0.0032)，而高剂量组CD8+ T细胞相比中剂量组(P=0.016)和低剂量组(P<0.001)有着更高的TNFα表达。
CD4+ T细胞 表达的IL-2高于CD8+ T细胞。
记忆型CD4+ T细胞的多功能表型高于CD8+ T细胞，另外在高剂量组中也观察到这种多功能表型细胞的比例最高（鲜红色）。
同样观察到预先存在的Ad5中和抗体对T细胞应答有负面影响：
一项事后分析显示，低中高剂量组中78%(28/36)、92%(33/36)和100%(36/36)的受试者在接种后第28天时候，拥有对S蛋白的T细胞应答，或者是对活SARS-CoV-2的中和抗体的血清学转换：
研究中为了避免任何可能的SARS-CoV-2暴露，研究人员在第28天时检测了所有受试者血清的SARS-CoV-2核衣壳蛋白的抗体，但是没有1例阳性。
讨论
这是首个Ad5载体的COVID-19在人体中的临床试验报道。Ad5-nCoV在三个剂量组的健康受试者中安全可耐受。最常见的不良反应包括发热、疲劳、头痛和肌肉疼痛，但是三个剂量之间的不良事件发生率没有显著差异。研究人员注意到1·5 × 10¹¹ vp的高剂量组有着更高的反应原谱，表现为严重的发热、疲劳、肌肉疼痛或关键疼痛，可能和Ad5感染引起的病毒血症相关。但是这些严重的不良事件都是瞬时且可以自愈。另外实验室检查中的异常改变也没有得到临床确诊或是被确认和疫苗相关。该临床中的安全谱与之前Ad5载体的Ebola病毒疫苗相似。为了加快这款COVID-19候选疫苗的临床评估，研究人员给予受试者在接种后7天和14天的安全谱选择了Ph2的剂量，即选择低剂量(0·5 × 10¹¹ vp)和中剂量(1·0 × 10¹¹ vp)进行进一步的Ph2评估。
Ad5-nCoV疫苗具有免疫原性，能够快速的诱导体液和T细胞应答。可测的免疫应答启动很快：T细胞应答在接种后第14天达到峰值，而抗体在第28天达到峰值。高剂量组的抗体应答比中低剂量组的稍强。单剂Ad5-nCoV疫苗能否在94-100%的受试者中引起RBD结合抗体升高4倍，在50-75%的受试者中引起活病毒中和抗体升高4倍。尽管检测方法有异，但是结合抗体与中和抗体滴度呈现出强烈的正相关。所有的剂量组中都有高比例的受试者报道了阳性的T细胞应答。接种疫苗的受试者中能同时观察到CD4+和CD8+ T细胞活化，特别是抗原特异的CD4+和CD8+ T细胞。但是，接种引起的特异性的抗体和T细胞应答在一定程度上被减弱。
目前还不清楚疫苗对COVID-19的保护作用，而特异性的抗体和T细胞如何构建有效的保护机制也不确定。因此无法就本研究中疫苗引起的免疫效应来预测Ad5-nCoV的免疫保护作用。先前SARS和MERS的研究发现，特异性的抗体的升高是临时性的，康复后会迅速降低，因此特异性的CD4+ 和CD8+ T细胞在免疫中起了关键的作用。同样COVID-19感染者在康复后也观察到特异性抗体的快速下降，提示特异性的细胞免疫和体液免疫在CDVID19疫苗的成功开发同样关键。这里研究者只报道了接种后28天的数据，但是会继续随访至少6个月，需要收集更多的数据。
该临床在湖北武汉进行，这里是中国COVID-19爆发的中心，生活在武汉的人相比湖北其他地区有着更高的SARS-CoV2感染风险。研究人员进行了血清学筛查、核酸检测及胸部CT来排除招募受试者时被SARS-CoV2感染。另外在接种后所有受试者需要在固定酒店观察14天，这些举措保证了临床不被SARS-CoV2影响，在没有安慰剂对照组的情况下这显得尤为重要。
结果的解释受限于小样本、随访时间短及没有随机对照组。由于这是Ad5-nCoV的FIH试验，所以并没有设计来检测疫苗的效果。但是在临床前研究中，8只雪貂在疫苗接种后的第21天进行SARS-CoV2挑战（鼻腔感染）有7只观察到了免疫保护，而对照组中8只雪貂只有1只病毒核酸拷贝检测阴性。研究人员主要目的是为了评估候选疫苗在健康成年人中的安全性和可耐受性，而不受流行基础疾病和药物影响。但是本研究显示年龄对疫苗疫苗诱导的对SARS-CoV2的应答存在负面影响。在本研究中没有一人在60岁以上，只有16%在50岁以上，所以疫苗能否在老年群体中产生强效的细胞及体液免疫的信息有限。由于年龄同样也是SARS-CoV2感染相关严重疾病的一个非独立危险因子，所以接下来的Ph2研究会纳入60岁以上的老年受试者。另外，SARS和MERS疫苗的开发经验也引发了对受试者接种疫苗后的ADE效应的关注，但是这个研究并没统计学功效去评估安全性事件，特别是关注全长S蛋白相关的免疫学及ADE。这项研究还发现预先存在的Ad5免疫能够减缓快速的免疫应答，特别是体验免疫；另外预先存在的高Ad5免疫同样对疫苗诱导的免疫应答的持久性也有负面影响。在临床前研究中，Ad5载体疫苗的异质性初免-加强(Prime-boost)或同源性Prime-boost免疫策略在预先存在高Ad5免疫的群体中可以诱导更强更持久的免疫应答。但是多剂量的Ad5载体CoVID-19疫苗在人体中的效果的信息依旧缺乏，未来需要更进一步的研究。
过去十年疫苗行业及临床研究中心被要求紧急应对新兴的感染疾病流行，包括H1N1甲流、Ebola、 Zika、MERS和现在的 SARS-CoV2。SARS-CoV2引发的COVID-19风险仍在持续，所以亟需有效的疫苗。研究人员20年1月份在 SARS-CoV2被率先分离和测序后就启动了疫苗的研发。之所以选择全长S蛋白作为抗原，也是基于先前SARS及MERS疫苗开发的经验：表达全长S蛋白的疫苗能够诱导很好的免疫应答并提供保护效果。尽管RBD包括了中和冠状病毒所需的关键结构域，但是在RBD外也鉴定出了中和表位，因为不管是 病毒载体还是mRNA亦或是DNA COVID-19疫苗，大多数还是选择全长S蛋白作为抗原。Ad5载体疫苗作为抗原输送系统已经证明高度有效且技术成熟。除了我们的Ad5-nCoV外，WHO列出的COVID-19候选疫苗愿景中还有其他几款基于Ad5载体的疫苗，包括美国的Ad5 S (GREVAXTM 平台) 和英国的口服 Ad5 S (Stabilitech Biopharma) 。除了预先存在的Ad5免疫外，还有担心Ad5激活CD4+ T细胞会增加感染HIV的风险；尽管Ad5载体疫苗与HIV感染风险增加间的关系仍然有争议且机制未明，研究病毒载体输送系统时仍需要考虑这个潜在风险。研究人员计划在将来的Ph2和Ph3研究中对受试者进行检测来类似的这类感染。
小结一下，研究人员发现Ad5-nCoV在健康成年人中可耐受且有免疫原性。在单次接种后，针对SARS-CoV2的特异性体液免疫在第28天达到峰值，而在第14天可以观察到快速的特异性T细胞应答。因此值得进一步研究Ad5-nCoV来控制COVID-19的爆发。目前中国正在开展Ph2研究(NCT04341389)以期获得Ad5-nCoV的安全性和免疫原性方面更多的信息。