科研│NAT COMMUN（IF：12.121）：单核转录组学揭示合胞体骨骼肌细胞的功能分区
编译：微科盟阿温，编辑：微科盟景行、江舜尧。
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合胞体骨骼肌细胞在同一个细胞质中含有数百个细胞核。研究者利用肌纤维分离细胞核的单核RNA测序（snRNA-seq）研究了未损伤和再生肌肉的核异质性和转录动力学。这揭示了与纤维类型多样性无关的不同的核亚型，以前未知的亚型以及神经肌肉和肌腱连接处的预期亚型。在Mdx营养不良小鼠模型的纤维中，出现了不同的亚型，其中表达修复信号的细胞核在营养不良患者的肌肉中也很丰富，以及与坏死纤维相关的细胞核群。最后，本研究方法的修改显示了罕见和特化的肌梭的区隔化，数据确定了肌纤维的核室，并为其功能分析定义了分子路线图；这些数据可以在MyoExplorer服务器上自由浏览 (https://shiny.mdc-berlin.de/MyoExplorer/)。
论文ID
原名：Single-nucleus transcriptomics reveals functional compartmentalization in syncytial skeletal muscle cells
译名：单核转录组学揭示合胞体骨骼肌细胞的功能分区
期刊：Nature Communication
IF：12.121
发表时间：2020年12月
通讯作者：Carmen Birchmeier & Altuna Akalin
通讯作者单位：马克斯·德尔布鲁克分子医学中心
DOI号：10.1038/s41467-020-20064-9
实验设计
结果
1 未损伤和再生肌肉的单核RNA序列分析
通过将肌纤维特异性Cre驱动因子（HSA-Cre）与Cre依赖性H2B-GFP报告子杂交，对小鼠肌核进行基因标记。H2B-GFP沉积在染色质上，这使研究者可以用流式细胞术分离单个肌核。再生纤维的细胞核在心脏毒素诱导损伤后7天（损伤后7天；7 d.p.i.）也被有效标记（补充图1a；注意未损伤和再生纤维的细胞核分别位于外周和中心）。研究者确认了H2BGFP标记的效率和特异性（补充图1a-c）。内皮细胞（Cd31+）、雪旺细胞（Egr2+）、组织内巨噬细胞（F4/80+）和肌肉干细胞（Pax7+）中缺乏H2B-GFP（补充图1c）；这些不同类型的细胞核位于纤维外，共同构成组织中所有细胞核的50%左右。
接下来建立了一个快速分离肌核的方案。传统的方法是在37℃下酶解肌肉纤维，这会引起基因表达的二次变化。研究者使用了一个程序，从解剖到流式细胞术需要20分钟，在冰上采用快速机械破坏。事实上，随后的分析表明，该方案避免了应激诱导基因的表达。
对于snRNA-seq分析，使用CEL-Seq2技术，这是一种高通量的基于平板的方法，具有很高的基因检测灵敏度。考虑到只有外显子读取和至少在5个核中检测到的基因，检测到每个核有1000-2000个基因（补充图2a，b）。在本研究中使用的所有样本中，线粒体读取阈值中位数为1.3%或更低（补充图2c）。研究者分析了未损伤（1591个）和再生胫前肌（TA）的细胞核（分别为7个和14个d.p.i.，946个和1661个）。这些数据集的统一流形近似和投影（UMAP）分析揭示了肌核之间的异质性（图1a）。所有细胞核都表达高水平的Ttn，一种泛肌肉标记物（图1b）。TA肌肉包含三种不同的纤维类型（IIA-中间型、IIB非常快速型和IIX快速型），它们表达不同的肌球蛋白基因。最大的团簇，即大块肌核，可分为不同纤维类型的核（图1b）；Myh1（IIX；团簇左下部分）或Myh4（IIB；团簇右上部分）阳性核最丰富，大约以1:1的比例出现。表达Myh2（IIA）的细胞核数量较少，与报道的纤维类型比例一致。值得注意的是，在UMAP图中，表达Myh2的细胞核主要位于Myh1阳性侧，而不是Myh4阳性侧（图1b）。通过荧光原位杂交（FISH），研究者可以很容易地观察到Myh1/Myh2共表达纤维，但不能观察到Myh2/Myh4纤维（补充图3）。
接下来，研究者定义了在再生过程中显示动态表达谱的基因（补充图4a和补充数据1）。例如，Arrdc2、Smox、Gpt2和Pdk4等基因在未损伤肌肉中强烈表达，但在再生过程中不表达，而Mettl21c、Cish和Slc26a2等基因在7d.p.i.特异表达。这些结果通过RT-qPCR使用分离的GFP+肌核和FISH进行验证（补充图4b，c）。
除了大量的肌核细胞群外，研究者还检测到具有非常独特的转录组的较小群体，这些转录组表达像Ttn这样的泛肌肉基因（图1a，c）。与体细胞核一样，这些群体中不同的细胞核表达不同的肌球蛋白基因，表明异质性不是由纤维类型差异驱动的（图1b）。研究者首先搜索并鉴定了一个专门表达已知NMJ标记基因的簇，如Chrna1、Prkar1a、Ache和Chrne，这些基因存在于未损伤和再生的肌肉中5（图1d和补充数据2）。数据确定了许多以前不知道在NMJ特异表达的基因，如Vav3、Ablim2、Phldb2和Ufsp1（图1d）。这种标记物和已知标记物Prkar1a的FISH证实了它们在NMJ的特异性表达（图1e）。
图1. 未受伤和再生肌肉的核异质性。a在未损伤和再生肌肉的细胞核中检测到的转录本UMAP图。这些颜色可以识别不同的核群（左）或未损伤或再生肌肉的细胞核（右）。肌周细胞群在重新聚集大块肌核后确定，并在图3中进一步描述。b Ttn和肌球蛋白基因的表达确定了肌核。c特定基因的热图，富集在团簇中，而不是大块肌核。d先前已知或NMJ标记基因的小提琴图。E传统的FISH不能进行NMJ的标记（Prkar1a）和NMJ的基因鉴定（绿色）。
2 在肌腱连接处有两个不同的核群
在未损伤和再生肌肉中发现了两个明显不同的表达MTJ相关基因的核群，并将其命名为MTJ-A和MTJ-B（图2a和补充数据2）。MTJ-A细胞核表达的基因，已知其蛋白质产物在MTJ处富集（例如Itgb1）以及特定的胶原蛋白（例如Col24a1和Col22a1）。Col22a1已经在斑马鱼中通过吗啉基敲除来破坏MTJ的形成。MTJ-B核表达一组已知沉积在MTJ的胶原，如Col1a2、Col6a1和Col6a3。Col6a1的表达尤其显著，因为它的突变导致了以MTJ缺陷为特征的Bethlem肌病。
使用FISH验证了MTJ-A的两个顶部标记基因（Tigd4和Col22a1），并观察了它们在纤维末端细胞核中的表达（图2b和补充图5）。这些转录本仅在H2B-GFP阳性的肌细胞核中表达，仅存在于MTJ。与未受伤的肌肉相比，它们在14d.p.i.时的表达更加明显（图2b）。为了观察合胞体内的异质性，研究者分离了单纤维并进行了双FISH（图2c）。Tigd4-FISH信号出现在MTJ所在的纤维末端，而Ufsp1转录本出现在NMJ所在的纤维中部。
在未损伤肌肉和14 d.p.i.的MTJ处检测到H2B-GFP核表达的MTJ-B基因（Pdgfrb，Col6a3）转录本（补充图6）。还证实，Ebf1蛋白存在于靠近MTJ的H2B-GFP阳性肌核中（图2b）。已知Pdgfrb和Col6a3在结缔组织中表达，并且确实在位于MTJ远端和纤维外的细胞中也检测到这些转录本（补充图6）。然而，这些细胞既未被H2B-GFP标记，也未被Ttn标记。因此，共表达肌肉基因和Pdgfrb、Col6a3或Ebf1的MTJ-B核仅位于肌纤维末端。与MTJ-A核不同的是，并非所有纤维中都有表达MTJ-B信号的核。由于MTJ-B标记既包括肌纤维的标记，也包括结缔组织细胞的标记，将MTJ-B细胞核的基因标记与肌肉组织中已知细胞类型的标记进行了比较，特别是与先前排除合胞肌纤维的单细胞测序实验中确定的结缔组织细胞类型进行了比较。这些细胞类型均未表达MTJ-B信号。因此，MTJ-B代表肌纤维中的一个核群体，它共同表达肌纤维（例如Ttn）和结缔组织（Pdgfrb、Col6a3、Ebf1）的典型基因。
3 其他肌核细胞群的鉴定
通过本研究的系统分析进一步确定了先前未知的肌核区室，在图3a中显示了每个群体优先表达的典型基因。其中第一个以顶部标记Rian命名，Rian是一种母系印记的lncRNA。该簇还表达了其他所有位于同一基因组位点（也称为Dlk1-Dio3位点）的lncRNAs，如Mirg和Meg3（图3a、b和补充数据3）。Dlk1-Dio3位点还编码大量从母体等位基因表达的microRNA，其中microRNA已知靶向由细胞核编码的线粒体蛋白转录本。针对Rian转录本的FISH在肌核的一个亚群中显示出清晰而强烈的表达（图3c）。分离纤维上的FISH显示Rian表达核的分散定位，没有明显的位置偏好（图3d）。以前的一项研究报道Dlk1-Dio3基因座在肌源性分化过程中变得不活跃。然而，本研究结果表明，一些肌细胞核保留表达，这可能是重要的代谢形成的纤维。
第二个簇的顶部标记是Gssos2，一种反义lncRNA，这些细胞核表达很多在内质网（ER）相关蛋白翻译和运输中起作用的基因（图3a，b）。Tmem170a和Rab40b可诱导活性蛋白翻译位点内质网的形成，Rab40b定位于高尔基体/内体并调节转运。此外，srpRNA（信号识别颗粒RNA）Rn7s6是内质网结合核糖体的一个组成部分，在这个群体中显著富集（图3a，b）。当重复元素的表达被量化时，也观察到srpRNA的富集（补充图7）。FISH结果显示，Gssos2在肌细胞核的一个亚群中表现出异质性和强表达，Rian和Gssos2在不同的细胞核中表达；我们检测了2个个体的100多个Rian+或Gssos2+细胞核，没有观察到共表达的细胞核（图3c；补充图8a）。Rian和Gssos2位于远离NMJ核的位置（补充图8b）。因此，Rian+和Gssos2+核代表独立的核群。
剩下的两个群体（Suz12+和Bcl2+核）需要进一步的鉴定。Suz12+核表达的前两个标记分别是Suz12（一个核心多梳复合体成分）和Halr1（一个从Hoxa基因座表达的长的非编码RNA），这表明表观基因调控的特定机制可能在这些核中使用。Bcl2+细胞核强烈表达与类固醇信号有关的基因，如Osbpl3（氧化固醇结合蛋白）和Nr2f1（类固醇敏感核受体）。
图1a中大块肌核的重新聚集显示了额外的核亚群（图3e和补充图9）。该亚群的特征是标记基因如Muc13和Gucy2e的富集（图3a，e）。FISH显示，表达Muc13的肌核总是位于肌周附近肌肉组织的最外层（图3f）。先前的超微结构研究表明肌纤维和肌周组织建立了专门的粘附结构，数据表明研究者已经检测到一个参与这个过程的肌核室。
图3. 其他核亚型的鉴定。a在每个核群体中富集的标记基因以小提琴图的形式呈现。b Rian+和Gssos2+核的势函数图解。Rian+核可能通过嵌入Dlk1-Dio3位点的microRNA调节局部线粒体代谢，而Gssos2+核可能调节局部蛋白质合成和进入分泌途径。c通过单分子FISH在未损伤肌肉中验证Rian+和Gssos2+核的顶部标记。d Rian在离体EDL纤维中的表达。插图显示指示区域的放大率。e（左）图1a所示的重新聚集的大块肌核的UMAP图，（右）热图显示肌周核与其余大块肌核的差异表达基因，显示每个基因的平均基因表达水平。f通过单分子FISH验证未损伤肌肉中邻近肌周的肌细胞核中Muc13的表达。
4 Mdx营养不良模型中纤维的snRNA-seq
为了开始了解肌肉疾病中肌核异质性是否以及如何改变，研究者在Mdx纤维（1939个细胞核）上进行了snRNA-seq，这是一种由肌营养不良蛋白基因突变引起的肌营养不良小鼠模型（图4a和补充图10a）。为了研究Mdx肌核转录组与未损伤和再生肌肉转录组的关系，研究者根据区分未损伤和再生纤维的前25个基因计算了每个肌核的基因特征分数。这表明Mdx肌肉的细胞核大部分类似于未损伤的和14个d.p.i肌肉的细胞核，而7个d.p.i肌纤维的特征消失（图4b）。簇A显示的标记基因大部分与未损伤纤维（如Arrdc2、Glul、Smox和Gpt2）的特异基因共享（图4c和补充图4a），并且可能对应于很少受损或未受损纤维的细胞核。
在Mdx数据集中发现了未损伤/再生肌肉中未发现的核种群。第一种是高表达的各种非编码转录本，进一步的实验表明，表达这些转录本的细胞核位于染色纤维内（图4c和补充图10b）。特别是，用小鼠IgG染色鉴定膜渗漏的纤维，证明这些ncRNAs在IgG+纤维中表达（图4d）。此外，高表达这些ncRNAs的纤维可能被与巨噬细胞对应的H2B-GFP阴性细胞高度浸润（补充图10c，d）。与这些细胞核代表死亡纤维的观点一致，它们的UMI计数较低，表明转录活性较低或mRNA降解较高（图4c中的底部直方图）。ncRNAs是纤维死亡的结果还是积极因素还需要进一步研究。此外，在UMAP图谱中相邻的三个群体（B1-B3）的UMI计数较低，但没有显示任何明确的标记基因。研究人员推测这些细胞核也可能起源于受损的纤维。
接下来，在未受伤和再生的肌肉中寻找确定的簇。在Mdx数据集的UMAP中，与NMJ、MTJ-A、MTJ-B、Rian+、Gssos2+和Bcl2+群体相对应的聚类不可识别。然而，检测到两个亚群也存在于未损伤/再生的肌肉中，Suz12+和肌周核，表明有一定程度的特异性（图4a）。因此，研究者使用基因标记分数来识别显示相关标记基因表达的细胞核。这种检查表明，在UMAP中存在MTJ-A核，但没有聚集在一起（补充图10e）。然而，MTJ-A标记基因（Tigd4和Col22a1）有力地标记了Mdx肌肉的MTJ（补充图10f）。推测纤维水平的异质性（如染色纤维、完整纤维和再生纤维）驱动Mdx中UMAP图的形状，这可能干扰MTJ-A核的聚集。与MTJ-A不同的是，NMJ、MTJ-B、Rian+、Gssos2+和Bcl2+标记分数较高的细胞核未被检出。进一步研究了NMJ基因的表达。这表明对照肌肉中典型的两个NMJ标记基因（Ufsp1和Prkar1a）的共表达丢失，这些基因反而以分散的方式在Mdx肌肉中表达（补充图10f）。值得注意的是，在Mdx小鼠中，NMJ的组织结构被认为是碎片化的，数据表明突触后核也不完全指定。
5 Mdx模型中核群的出现与纤维损伤修复有关
图4a中“纤维修复”簇的标记基因显示与人类肌肉疾病相关的本体术语丰富（图4e）。事实上，许多顶级标记基因在人类肌病中发生突变（Flnc、Klhl40和Fhl1）或直接与突变导致疾病的蛋白质相互作用（Ahnak与dysferlin相互作用；Hsp7b或Xirp1与Flnc相互作用）。组织切片中的组合FISH证实了这种标记基因在Mdx肌肉的一个子集细胞核中的共表达，但这种细胞核在对照肌肉中不存在（图4f，补充图11a，b）。此外，表达这些基因的细胞核经常在纤维中密集分布。研究还证实，FLNC和XIRP1在肌营养不良蛋白突变的患者活检细胞核中共同表达，但在健康人体肌肉中不表达（图4g和补充图11a）。
以前的研究已经证实Flnc和Xirp1蛋白定位于肌原纤维损伤部位以修复这种损伤，而Dysferlin，Ahnak的相互作用蛋白在肌膜损伤修复过程中发挥作用。我们的分析表明，这些基因是转录共同调控的，可能发生在对微损伤的反应中。为了证实这一特征并非肌营养不良蛋白突变引起的肌营养不良症的特异性，研究了在肌营养不良蛋白缺乏的肌肉中是否可以识别出这些特征，在肌营养不良蛋白缺乏的肌肉中，持续的膜微损伤不再被有效修复。同样，在小鼠疾病模型和DYSFERLIN突变患者的活检组织中观察到核共同表达Flnc和Xirp1（补充图11c，d）。作者认为标记这个簇的基因代表一个“修复”信号。值得注意的是，在出生后发育后期和老化肌肉中发现了类似的人群，表明“修复”基因也可能在纤维重塑过程中发挥作用。
最后，在Mdx肌肉中鉴定了另一个先前未知的群体—C群，其表达了先前在肌肉环境中未研究过的标记基因，如Gpatch2、Emilin1和Pde6a（图4c和补充数据3）。这个群体在肌肉病理生理学中的作用需要进一步的描述。
6 肌梭纤维的核异质性
原则上，本研究的方法可用于探索特定纤维类型的核异质性。因此，作者旨在研究检测肌肉伸展和运动协调功能的肌梭的异质性。肌梭非常罕见，在小鼠的TA肌中约有10个肌梭。它们含有袋状和链状纤维，其组织学显示进一步的分隔（图5a）。HSA-Cre标记纺锤体的肌核（图5b），但绝大多数的肌核来自梭外纤维。为了克服这一点，使用Calb1-Cre特异性分离梭形肌纤维核（图5b），并在这些特殊纤维内发现了不同的核亚型（图5c）。
袋状纤维是慢纤维，表达Myh7b，而链状纤维是快纤维。一个表达Myh7b和Tnnt1（一种慢型肌钙蛋白异构体）的簇被分配用于标记Bag纤维。相反，两个簇表达Myh13，一种快速型肌球蛋白，或Tnnt3，一种快速型肌钙蛋白，作者称之为Chain1和Chain2。引人注目的是，研究者发现了一个簇，该簇表达一组与梭外纤维NMJ核中基因（如Chrne、Ufsp1和Ache）有很大重叠的基因，将其命名为纺锤体NMJ（spdNMJ）（图5d，e）。此外，纺锤体肌腱核（spdMTJ）表达了一组与梭外纤维MTJ-B核中的基因显著重叠的基因（图5d，e），未检测到MTJ-A标记。值得注意的是，团簇Bag和spdNMJ表达了机械感觉通道Piezo2。为了验证分配和确定一个额外的大隔室（标记为Sens）的同一性，在组织切片（补充图12b）和人工分离后的纤维（图5f）中验证了Calb1-Cre肌肉的H2BGFP阳性纤维中不同标记基因的表达。作为感觉簇的一个标记物，Calcrl的FISH显示了纺锤体纤维的中心部分的特异性定位，纺锤体纤维含有密集的细胞核，即感觉神经元的支配部位（图5f）。在同一根纤维中，spdNMJ标记基因Ufsp1的转录本作为一个明显的侧方焦点定位。相反，Piezo2在纤维的横向收缩部分表达，但不在中央部分。因此，感觉神经元接触的肌梭的中央非收缩部分代表了一个纤维室，具有与spdNMJ明显不同的特殊肌核。
7 跨不同部位的转录调控因子分析
为了深入了解不同核区室的转录控制，研究了转录因子和表观遗传调节因子的表达谱（图6a和补充数据4）。值得注意的是，编码Etv5（也称为Erm）的转录本（一种已知可诱导NMJ转录组的转录因子）及其功能同源物Etv4在NMJ细胞核中富集。Irf8（NMJ中的第3秩因子）也很有趣，因为CHRNA启动子中Irf8结合位点的突变导致CHRNA在胸腺中的错误表达，并导致自身免疫性疾病重症肌无力，这意味着Irf8控制肌肉外组织中的NMJ基因。在MTJ-A核中，TGF-β信号传导的效应子Smad3是第二级因子。此外，TGF-β受体也在MTJ-A肌核表达。TGF-β是由腱细胞强制释放的，是维持腱细胞所必需的，但数据表明MTJ肌核也能接收TGF-β信号。
为了测试数据集是否能够识别功能相关因子，选择进一步研究Ebf1，即MTJ-B中最丰富的转录激活因子。Ebf1的芯片序列数据（ENCSR000DZQ编码项目）显示，Ebf1直接与确定为MTJ-B标记的约70%的基因结合（图6b）。相反，Ebf1与NMJ或MTJ-A标记基因的结合率不到30%。研究者建立了一个C2C12细胞系，其中Ebf1的表达是由强力霉素诱导的（图6c）。对所选标记物的RT-qPCR分析表明，其中许多标记物在Ebf1过度表达（图6d）的情况下以剂量依赖的方式诱导，ColVI蛋白也是如此（图6c）。为了在体内验证这些发现，分析了Ebf1突变肌肉。利用FISH-for-Ttn鉴定肌核，观察到与对照MTJ肌核相比，Ebf1突变体中的Col6a3和Fst1l转录本显著减少（图6e）。同时表达Ebf1的非单核细胞的表达也减少了。相反，NMJ、MTJ-A和Rian标记的表达在Ebf1突变体中不受影响（补充图13）。综上所述，本研究数据集提供了一个模板，用于识别建立或维持这些分区的调控因素。
讨论
鉴于肌肉组织的庞大和复杂，肌核的多样性可能需要进一步的探索。这里，集中分析一个单一的肌肉群，胫骨前肌，主要包含快速纤维，并确定了未受伤、再生和营养不良肌肉的转录异质性和程序。成功地使用snRNA-seq来定义出生后、成人和老年人胫骨前肌的核亚型。这两项研究确定了一组重叠的区室，但每个区室也发现了不同的区室，强调了肌肉中转录区室高度依赖于疾病或年龄等变量的事实。此外，两项研究采用了不同的分离策略和snRNA测序方法。研究者的策略确定了罕见的MTJ-B或肌周核亚型，而其他人没有检测到，因此基因标记和分离肌核的策略应该有希望在其他肌群和环境中识别核亚型。然而，在分析一组随机肌核的数据集中，没有检测到来自肌梭的核，这是一种非常罕见的特殊纤维类型，但通过限制基因标记克服了这一限制。纺锤体细胞核的snRNA-seq分析揭示了这些稀有纤维内的许多亚型，特别是在本体感觉神经元的神经支配部位存在一个特殊的隔室。更普遍地说，本研究方法应该有助于研究其他合胞细胞类型，如胎盘滋养层或破骨细胞。
1 科研│INT J MOL SCI：间歇性缺氧小鼠内脏脂肪单细胞转录组变化
不来关注一波嘛
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