科研 | Cell Metabolism：谷氨酰胺是肥胖与人类白色脂肪组织炎症间的枢纽
编译：孙元芳，编辑：Emma、江舜尧。
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虽然肥胖和相关的代谢并发症与白色脂肪组织(WAT)的炎症有关，但其原因尚不清楚。研究人员推测局部代谢环境可能是一个重要的决定因素。为此，我们比较了81名肥胖和非肥胖女性的WAT产生的代谢物。研究结果表明谷氨酰胺在肥胖女性的WAT中下调，并与恶性表型呈现负相关。后续体外和体内实验均发现，给予谷氨酰胺可降低脂肪细胞和巨噬细胞浸润中的促炎基因及蛋白水平。人体脂肪细胞的代谢组学和生物能量分析表明谷氨酰胺减弱了糖酵解作用，降低了尿苷二磷酸N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)水平。UDP-GlcNAc是O-乙酰氨基葡萄糖(O-GlcNAc)转移酶介导的 O-GlcNAc翻译后修饰的底物。通过人类脂肪细胞的功能研究建立了谷氨酰胺还原、核蛋白O-糖基化和促炎转录反应之间的机制联系。总之，在肥胖状态下谷氨酰胺代谢与WAT的炎症相关。
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实验设计
采用非靶向代谢组学描述了52名肥胖和29名非肥胖女性（列队1）的离体皮下腹部WAT释放的极性代谢物轮廓，统计学分析确定差异代谢产物。对56名非肥胖和肥胖女性组成的队列(队列2)的WAT进行转录组学分析，寻找显著差异的基因。随后对差异表达基因进行了GO分析。
为了评估体内的谷氨酰胺是否可以影响WAT炎症，我们向雄性C57BL / 6小鼠腹腔内注射谷氨酰胺，2周后分析附睾WAT中的促炎基因。随后对小鼠进行了5周高脂饮食(HFD)，在HFD的最后2周注射了谷氨酰胺或PBS，评估谷氨酰胺在肥胖小鼠中的作用。
我们培养了不同水平的谷氨酰胺共孵育的人体外分化脂肪细胞，11天后对条件培养基进行qPCR测序分析。并且从人类WAT中分离出原代细胞，测定高或低谷氨酰胺孵育48小时对其的影响。对体外分化脂肪细胞和人类WAT细胞进行生物能量分析和非靶向代谢组学分析，更加详细地研究谷氨酰胺对代谢的影响。随后通过基因敲除和药理抑制，验证谷氨酰胺与WAT炎症之间的因果关系。
为了研究人类脂肪细胞O-GlcNAc糖基化蛋白质组及其可能参与的转录调控，使用泛O-GlcNAc抗体免疫沉淀核蛋白，然后进行非靶向蛋白质组学研究。在低或高浓度谷氨酰胺培养的体外分化的人脂肪细胞中，通过染色质免疫沉淀和DNA测序沿着基因组绘制O-GlcNAc糖基化蛋白质组。通过生物信息学分析描述人类WAT中谷氨酰胺与炎症的联系机制。
实验结果
1. 肥胖个体的WAT显示出较低的谷氨酰胺水平
我们着手绘制了52名肥胖和29名非肥胖女性（列队1）的离体皮下腹部WAT的代谢轮廓图。该研究确定了六种差异代谢产物，它们在非肥胖者和肥胖者之间显示出高度显著(p < 0.01)差异（图1A）。其中谷氨酰胺的变化倍数最大，显著性水平最高，因此选择谷氨酰胺进行更深入的分析。从队列1的个体子集（n = 26）中获取WAT裂解液，分析发现肥胖受试者的组织中谷氨酰胺水平较低（图1B）。肥胖和非肥胖个体的血清样本中，谷氨酰胺水平有轻微但不显著的差异(图1C)。肥胖与WAT裂解液中检测到的谷氨酰胺水平相关(图1D)，但与血清谷氨酰胺水平无关(图1E)，这表明肥胖人群的谷氨酰胺水平在人类WAT中存在局部失调。对WAT谷氨酰胺释放的进一步分析显示，体重指数与脂肪细胞体积(图1F)和体脂百分比(%)呈反向独立相关(图1G)。这些数据表明，WAT中减少的谷氨酰胺水平与脂肪质量和脂肪细胞大小的增加有关。
2. 肥胖个体的脂肪组织特征是谷氨酰胺代谢基因的表达改变
使用先前描述的由56名非肥胖和肥胖女性组成的队列(队列2)的转录组数据，反映编码谷氨酰胺调控蛋白的基因表达及其与肥胖的关系。在26个被分析的基因中，有13个在肥胖和非肥胖受试者之间有显著差异。GLUL的倍数差异最大，显著性最高，其在肥胖组中表达量较低(图1H)。GLUL编码谷氨酰胺合成酶，它以谷氨酸为底物，是唯一已知的谷氨酰胺合成酶(图1I)。通过分析肥胖女性在减肥手术前和术后2年以及未肥胖对照组(队列3)的WAT，显示减肥后GLUL的正常化(图1J)，这一结果进一步证明了脂肪量影响GLUL表达的观点。在蛋白水平上，肥胖个体WAT中的GLUL水平较低(图1K)。考虑到图1F中谷氨酰胺释放和脂肪细胞体积之间独立于体重指数的相关性，我们在队列2中根据脂肪细胞形态(肥大/增生)对受试者进行细分。含有恶性肥厚表型脂肪细胞的肥胖和非肥胖受试者GLUL表达均较低(图1L)。WAT是一个由多种细胞组成的异质器官，所有这些细胞都有助于代谢产物的释放。肥胖患者离体脂肪细胞和完整器官中GLUL的表达均较低(图1M)。对8种不同WAT细胞组分的芯片数据分析显示，GLUL在脂肪细胞组分中表达最高，但在肥胖的其他细胞组分中表达水平较低(图1N)。总之，这表明肥胖和非肥胖人群谷氨酰胺释放的差异是由谷氨酰胺合成酶水平驱动的。
图1 谷氨酰胺水平降低是肥胖WAT的代谢特征
(A) WAT在队列1 (n = 81)中释放的极性代谢物在火山图中表示，x轴上的fold change (log2)表示肥胖(OB)与不肥胖(NO)受试者的水平，y轴上的p值(log10)表示p值的变化。显著(p < 0.01)被调节的代谢物以颜色标记: 在肥胖中，红色表达下调，蓝色表达上调(左图)。在NO和OB受试者的个体值的条形图中显示了谷氨酰胺的水平(右图)；(B)比较队列1子集（n=26）中NO和OB个体之间的整个WAT中谷氨酰胺水平(log10)；(C)比较队列1(n = 53)中NO和OB个体之间的血清谷氨酰胺水平(log10)；(D和E)WAT释放谷氨酰胺与WAT谷氨酰胺(D)及血清谷氨酰胺水平(E)的相关性；(F和G)进行谷氨酰胺释放量与脂肪细胞体积(F)或体脂百分比(G)之间的多元回归分析，并根据BMI进行校正。图中显示了p值和标准化的贝塔系数；(H) 火山图展示了在OB和NO (队列2) 中的WAT转录组中谷氨酸代谢基因的mRNA表达情况，GLUL标记为红色；(I)谷氨酰胺合成酶(GLUL)功能示意图；(J)通过qPCR检测了减肥手术前(OB, N=15)和术后(PO)肥胖女性以及与术后肥胖女性年龄和BMI匹配的未肥胖女性对照组(NO, n = 15) (队列3)的全脂肪组织中GLUL mRNA的表达；(K)免疫印迹分析NO和OB个体的整个WAT中的GLUL表达量(左图)，并将GLUL蛋白表达的相对定量绘制在显示个体值的条形图中(右图)；(L)比较根据脂肪细胞形态(肥大/增生)细分的队列2中NO和OB个体的GLUL表达；(M) qPCR分析NO和OB受试者成熟脂肪细胞和全脂肪组织中GLUL基因的表达；(N)基因芯片测定的GLUL在人皮下不同细胞部分的表达，包括成熟脂肪细胞、脂肪细胞祖细胞(APC)、脂肪组织巨噬细胞(ATM、M1、M2)、T细胞(total、CD4+、CD8+)。两组间比较采用Student’s t检验，几组间比较采用单因素方差分析(Tukey’s post hoc test)。
3. 低谷氨酰胺合成酶表达与人脂肪组织的促炎途径相关
为了了解谷氨酰胺在WAT中的作用，我们对GLUL表达相关基因进行了GO分析。这表明GLUL与脂质和碳水化合物代谢生物学过程中的基因呈正相关，但与炎症过程和组织重塑呈负相关(图2A)。在蛋白质水平上证实了GLUL与炎症的相关性，因为GLUL与促炎性细胞因子和趋化因子，CC趋化因子配体2（CCL2）（图2B），白介素6（IL6）（图2C）和肿瘤坏死因子α（TNFa）（图2D）的分泌呈负相关。在多元回归分析中，IL6和CCL2的相关性是独立于体重指数的。
4. 谷氨酰胺减弱小鼠脂肪组织中的促炎途径
为了评估谷氨酰胺是否可以在体内影响WAT炎症，每天向腹腔内注射谷氨酰胺的雄性C57BL / 6小鼠（图2E），2周后分析附睾WAT中的促炎基因（图2F）。我们对小鼠进行了5周高脂饮食(HFD)，在HFD的最后2周注射了谷氨酰胺或PBS，评估谷氨酰胺在肥胖小鼠中的作用(图2G)。附睾WAT的基因表达分析证实，HFD增加了所有促炎基因的表达，而在注射谷氨酰胺的动物中这些基因的表达被减弱(图2H)。同样地，附睾WAT的F4 / 80免疫组织荧光显示了相似的模式（图2I，2K），流式细胞仪证实促炎性巨噬细胞（CD11c+）的比例在谷氨酰胺治疗的小鼠中已正常化（图2L）。
图2 谷氨酰胺调节WAT的炎症
(A)与GLUL mRNA表达呈负相关的基因GO分析；(B-D) GLUL mRNA表达与离体WAT释放的CCL2 (B)、IL6 (C)、TNFa (D)的相关性的多元回归分析(队列2)，纳入BMI作为独立回归因子，校正后将标准化的beta系数和p值显示在图中；（E）以正常饲料喂养的小鼠对谷氨酰胺的干预行为的示意图：每天向小鼠腹膜内注射谷氨酰胺（1 g / kg体重）或PBS（20 mL / kg体重），持续2周。处死后，分离出附睾WAT样品，通过qPCR进行基因表达分析；(F) PBS或谷氨酰胺处理的正常饲料喂养的小鼠的附睾WAT的基因表达情况；(G)谷氨酰胺对喂正常饲料或高脂肪饲料的小鼠进行干预的示意图；（H）通过（G）所示进行干预的动物的附睾WAT中基因表达情况；(I-K)三组动物的附睾WAT的代表性显微照片，巨噬细胞标记物F4/80(绿色)和CellMask(红色)染色，标尺：100毫米；(L)流式细胞术检测CD11-c阳性细胞在(G)小鼠附睾WAT基质血管组分中的比例。
5. 高谷氨酰胺水平可减轻人脂肪细胞和白细胞的炎症
谷氨酰胺代谢与T细胞和巨噬细胞重编程之间的联系已得到确认。但谷氨酰胺对人脂肪细胞的影响尚无研究。因此，我们培养了不同水平的谷氨酰胺共孵育的人体外分化脂肪细胞，11天后对条件培养基进行qPCR测序分析。qPCR分析显示，谷氨酰胺对CCL2、IL1B和IL6的表达(TNFA在细胞培养中低于检测限)影响呈浓度依赖性，在5-20mM时效果最大(图3A-3C)。在培养液中使用0.5mM(L)或10 mM(H)的谷氨酰胺来进一步评估时间诱导效应。结果表明CCL2、IL1B和IL6的mRNA水平在第11天诱导后显著下降(图3D-3F)。整体转录分析证实了高浓度谷氨酰胺培养的细胞具有抗炎作用(图S3C;表S5)，并在蛋白水平上得到验证(图3G-3I)。另外将体外分化的脂肪细胞在低、高谷氨酰胺培养11天后，分别转变为高、低谷氨酰胺水平 (图3J-3L)。这表明谷氨酰胺由低到高的转换在6h内减弱了促炎基因的mRNA水平。这些研究是在体外分化的脂肪细胞中进行的，可能不同于体内成熟的脂肪细胞，而且WAT组成包含其他额外的细胞类型。因此，我们还从人类WAT中分离出原代细胞，并测定高或低谷氨酰胺孵育48小时的效果（图3M-3O）。高谷氨酰胺的孵育可对巨噬细胞、T细胞和成熟脂肪细胞产生抗炎作用，后者在蛋白水平也表现出抗炎作用(图3P-3R)。相反，在脂肪细胞祖细胞中没有可检测到类似的结果(图3M-3O)。总之，我们的数据证实了谷氨酰胺对巨噬细胞和T细胞具有抗炎作用，并将其扩展到分化的脂肪细胞和体内WAT。
图3 谷氨酰胺可以降低成熟脂肪细胞的促炎脂肪因子水平，但对祖细胞无影响
(A-C) qPCR分析CCL2 (A)、IL1B (B)和IL6 (C)体外分化的谷氨酰胺浓度0.5 ~ 20mM培养的人脂肪细胞；（D-F）qPCR分析高（H，10 mM）或低（L，0.5 mM）谷氨酰胺孵育的体外培养人脂肪细胞中CCL2（D）、IL1B（E）和IL6（F）的表达；（G-I）在高（H）或低（L）谷氨酰胺水平下培养的细胞分化第11天CCL2（G）、IL1B（H）和IL6（I）的释放量；（J-L）对CCL2（J）、IL1B（K）和IL6（L）的qPCR分析评估体外分化脂肪细胞在分化第11天从高到低（H/L）或从低到高（L/H）谷氨酰胺浓度的转换；（M-O）在高（H）或低（L）谷氨酰胺培养基中培养48h的不同细胞类型的人脂肪组织中CCL2（M）、IL1B（N）和IL6（O）的表达量；（P-R）在高（H）或低（L）谷氨酰胺培养基中培养48h的成熟脂肪细胞释放的CCL2（P）、IL1B（Q）和IL6（R）含量。
6. 高谷氨酰胺水平抑制脂肪细胞的糖酵解
谷氨酰胺是一种能量来源，通过转化为谷氨酸和酮戊二酸来为柠檬酸循环提供燃料。在免疫细胞中，谷氨酰胺通过将能量底物利用从糖酵解转移到谷氨酰胺分解来影响细胞表型。这些调控作用部分归因于中间代谢物水平的改变，导致染色质重塑和基因转录改变。因此，我们推测谷氨酰胺可能通过改变细胞内代谢来诱导人脂肪细胞的抗炎作用。生物能量分析显示，在高谷氨酰胺处理的细胞中，糖酵解速率降低是因为细胞外酸化速率(ECAR)相对于耗氧速率(OCR)降低了 (图4A-4C)。与此一致，细胞在利用谷氨酰胺作为能量来源方面效率更高(图4D)。此外，它们对葡萄糖的糖酵解能力降低(图4E)，葡萄糖摄取减少(图4F)。脂肪细胞中IL1B和IL6 mRNA表达的葡萄糖依赖性增加，而谷氨酰胺浓度的增加又使其减弱，进一步表明糖酵解的减少会影响促炎基因的表达(图4G – 4I)。此外，在低(而不是高)谷氨酰胺孵育的细胞中加入糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖(2DG，己糖激酶的竞争性抑制剂;图S4A)，观察到了糖酵解减弱(图4J)， CCL2、IL1B和IL6基因表达和蛋白分泌降低(图4K-4P)。
图4 谷氨酰胺通过减少糖酵解作用减轻炎症
(A-C)基础糖酵解速率以细胞外酸化速率(ECAR) (A)表达，氧化速率以耗氧速率(OCR) (B)表达，以及体外分化的人脂肪细胞在高(H, 10 mM)或低(L, 0.5 mM)谷氨酰胺培养11天的比值(C)；(D和E)高(H)或低(L)谷氨酰胺水平培养的体外分化人脂肪细胞对谷氨酰胺(D)和葡萄糖(E)的代谢弹性；(F)高(H)或低(L)谷氨酰胺浓度培养的体外分化人脂肪细胞葡萄糖摄取水平；(G-I)不同浓度葡萄糖(1-10 mM)和谷氨酰胺(0.5-20 mM)组合培养细胞中CCL2 (G)、IL1B (H)和IL6 (I)基因的表达；(J)在高(H)或低(L)谷氨酰胺中孵育的人体脂肪细胞添加(0.1 mM)或不添加竞争性糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖(2DG) 24小时后，人体脂肪细胞对葡萄糖反应的代谢弹性；(K-P) CCL2 (K和L)、IL1B (M和N)、IL6 (O和P)在谷氨酰胺高、低浓度(含或不含2DG)处理细胞中的基因表达和蛋白分泌。
7. 代谢组学将低谷氨酰胺与核蛋白O-GlcNAc糖基化联系起来
对糖酵解的影响表明，谷氨酰胺重新调整细胞代谢状态，导致细胞内可能参与炎症相关基因的转录控制的代谢物含量改变。通过对培养于高浓度或低浓度谷氨酰胺的细胞进行非靶向代谢组学分析，可以获得关于特定代谢物调控的更详细信息。这证实了高谷氨酰胺降低了糖酵解过程中关键代谢物的水平，如葡萄糖-6-磷酸、3-磷酸甘油和磷酸烯醇丙酮酸(图S4A)。此外，谷氨酰胺在体外对极性代谢物水平的影响更大，特别是氨基酸和碳水化合物代谢(图5A)。为了深入了解谷氨酰胺诱导对细胞内代谢产物生理活性的影响，我们将这些数据与来自队列1亚组(n = 26)的WAT样本的代谢组学进行了比较。肥胖患者中特有的极性代谢物在细胞样品中都没有被富集到(图5B)。在体内和体外出现一致改变的极性代谢物很少。值得注意的是，与在免疫细胞中报道的情况相反，在体内和体外出现一致改变的极性代谢物不包括三羧酸循环代谢物(如α-酮戊二酸)，而是包括了谷氨酰胺本身(图5C)，景天庚酮糖-7-磷酸、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖/半乳糖胺(UDP-GlcNAc)、5-半乳糖基羟基-赖氨酸，N-乙酰谷氨酸和尿苷(图5 D-5F)。O-GlcNAc转移酶(OGT) 催化O-GlcNAc在丝氨酸或苏氨酸残基上的翻译后修饰，UDP-GlcNAc是其唯一底物。因此，我们对高、低谷氨酰胺处理的人脂肪细胞的细胞核和细胞质部分进行O-GlcNAc定量。这表明，高谷氨酰胺的孵育以浓度和葡萄糖依赖的方式减弱了细胞核中O-GlcNAc糖基化(图6A)。与体外数据一致的是，肥胖个体WAT的整体O-GlcNAc糖基化水平较高(图6B)，而在正常饲料喂养(图6C)或HFD喂养(图6D)并注射谷氨酰胺的小鼠WAT中O-GlcNAc糖基化水平较低(图6D)。综上所述，这些数据表明谷氨酰胺对糖酵解的削减作用降低了氨基己糖合成途径中代谢物的水平（包括UDP-GlcNAc和O-GlcNAc糖基化）。
图5 体外分化脂肪细胞和白色脂肪组织的整体代谢组学分析
(A)体外分化的人脂肪细胞中检测到的代谢物组的相对比例(左图)和谷氨酰胺高、低培养的细胞中差异调节的代谢物组的相对比例(右图)；(B)皮下WAT检测到的代谢物组的相对比例(左图)以及肥胖(OB)和非肥胖(NO) (队列1亚组，n = 26)之间有显著差异的代谢物组(右图)；(C和D)显著(p < 0.10)调控的代谢物之间的重叠代谢物在肥胖个体中较低，且在高谷氨酰胺中上调(C)，或在肥胖个体中更高，且在体外高谷氨酰胺中下调(D)；(E和F) (D)中重叠的五种代谢物分别在高、低谷氨酰胺处理的人类脂肪组织(E)，以及OB和NO受试者(F)的WAT中的水平。
8. 谷氨酰胺通过影响O-GlcNAc糖基化调控IL6和IL1B，而不调控CCL2
我们假设谷氨酰胺通过降低核蛋白O-GlcNAc糖基化介导部分抗炎作用。为了证明其因果关系，使用小分子干扰RNA（siRNA）敲除人脂肪细胞中OGT，并在高或低谷氨酰胺下孵育。与图3的数据一致，高谷氨酰胺降低了所测促炎因子的基因和蛋白表达(图6E-6J)。低谷氨酰胺条件下，OGT下调显著降低了IL1B和IL6的mRNA表达和蛋白分泌(图6G-6J)。相比之下，CCL2 mRNA没有受到影响(图6E)，其分泌水平甚至略有提高(图6F)。此外，GlcNAc-O-bn抑制OGT活性24小时与在低谷氨酰胺孵育的OGT敲除细胞中观察到的效果一致(图S6C-S6I)。相反，高谷氨酰胺孵育细胞加入PUGNAc (OGA的抑制剂，从蛋白质中去除O-GlcNAc分子的酶) 24 h后，O-GlcNAc糖基化增加(图S6C)， IL1B和IL6的表达/分泌也增加(图6K-6P)。这些结果支持谷氨酰胺通过O-GlcNAc糖基化降低特异性促炎基因表达的观点。
图6 谷氨酰胺通过蛋白O-GlcNAc糖基化调节炎症
（A-D）在（A）从与谷氨酰胺和葡萄糖的各种组合孵育的体外分化的脂肪细胞中分离出的脂肪细胞核中的蛋白O-GlcNAc糖基化的蛋白质印迹，（B）非肥胖（NO）和肥胖（OB）受试者的整个WAT，（C）来自用PBS（CD-PBS）或谷氨酰胺（CD-GLN）处理的正常饲料喂养的小鼠的eWAT，以及（D）来自PBS处理的正常饲料喂养小鼠（CD-PBS）和或谷氨酰胺（HF-GLN）处理的高脂肪饮食小鼠的整个WAT；（E-P）来自体外分化的脂肪细胞的CCL2（E，F，K和L），IL1B（G，H，M和N）和IL6（I，J，O和P）的基因表达和蛋白释放量，体外分化的脂肪细胞用高（H）或低（L）谷氨酰胺与靶向OGT（EJ）的siRNA或OGA抑制剂PUGNAc（后者以0.2 mM进行24小时，对照是DMSO）处理；（K-P）在siOGT实验中收集48小时（第9天到第11天）的条件培养基，而在PUGNAc处理的细胞中收集24 h后的条件培养基。
9. O-GlcNAc糖基化蛋白质组的特征及其在染色质上的空间定位
为了研究人类脂肪细胞O-GlcNAc糖基化蛋白质组及其可能参与的转录调控，使用泛O-GlcNAc抗体免疫沉淀核蛋白，然后进行非靶向蛋白质组学研究。鉴定出了400多个蛋白可被分为6个主要的蛋白相互作用体簇，分别涉及RNA加工、核糖体生物发生和蛋白质运输、细胞结构、染色质组织和表观遗传过程等生物过程 (图7A)。
参与染色质组织、RNA剪接和基因转录的蛋白质通过直接或间接地与染色质近端结合来调节它们的作用。因此，在低或高谷氨酰胺培养的体外分化的人脂肪细胞中，通过染色质免疫沉淀和DNA测序沿着基因组绘制O-GlcNAc糖基化蛋白质组。与图6A的结果一致，在高谷氨酰胺培养的脂肪细胞中染色质O-GlcNAc糖基化水平较低(图7B和7C)。通过对不同O-GlcNAc糖基化区域的基序结合分析，我们可以绘制出活性可能受到O-GlcNAc糖基化影响的转录因子(图7D)。在鉴定的转录因子中，蛋白质组分析发现只有SP1直接被O-GlcNAc糖基化(图7A)。在高或低谷氨酰胺培养的脂肪细胞的蛋白裂解物中，使用泛O-GlcNAc抗体进行免疫沉淀，然后使用抗SP1抗体检测，结果显示在高谷氨酰胺条件下，SP1的O-GlcNAc糖基化水平较低(图7E)。加入SP1的选择性抑制剂光辉霉素孵育24小时后，低和高谷氨酰胺水平孵育的细胞中IL1B和IL6的表达被抑制(图7F)。这表明谷氨酰胺通过O-GlcNAc糖基化诱导炎症相关基因表达的下调机制包含对特异性SP1靶点的调控（图7G）。
图7 O-GlcNAc糖基化与脂肪细胞炎症联系的机制
(A)从人体外分化的脂肪细胞中分离核裂解物，使用针对O-GlcNAc修饰蛋白的抗体进行免疫沉淀。随后是蛋白质组学分析，这是根据它们的相互作用体来表示的。如图所示，相互作用簇内蛋白质的共同功能用颜色表示；(B) ChIP-seq分析绘制出O-GlcNAc糖基化沿着染色质的定位；(C)比较(B)低(L, 0.5 mM)和高(H, 10mm)谷氨酰胺处理的体外分化脂肪细胞中ChIP-seq分析检测到的峰数；(D)对(B)中ChIP-seq中不同O-GlcNAc糖基化位点的Homer基序富集分析；(E)用抗O-GlcNAc抗体(IP) 和抗小鼠IgG免疫沉淀高、低谷氨酰胺培养的体外分化人脂肪细胞的核裂解物，然后使用抗SP1抗体进行免疫印迹；(F)低(L)和高(H)谷氨酰胺水平和有无SP1抑制剂光辉霉素处理的体外分化脂肪细胞中IL1B(左图)和IL6(右图)表达量；(G)概述谷氨酰胺与炎症基因转录调节机制的图解。在这个模型中，谷氨酰胺通过降低糖酵解和HBP通量降低UDP-GlcNAc，从而降低O-GlcNAc糖基化蛋白，包括SP1在内的多种蛋白质（Px，Py）的O-GlcNAc糖基化减少导致促炎基因的转录活性减弱。
讨论
在此，我们报道谷氨酰胺是WAT中的一种免疫代谢调节剂，它将肥胖与炎症联系起来。至少在脂肪细胞中，谷氨酰胺水平降低导致UDP-GlcNAc水平升高和位于炎症基因附近的染色质结合蛋白O-GlcNAc糖基化。我们在脂肪细胞中观察到的结果，结合之前巨噬细胞和T细胞中谷氨酰胺代谢的数据，支持了代谢微环境通过对几种细胞类型的协同作用影响WAT功能的观点。
大多数使用代谢组学比较瘦人和肥胖受试者的研究都集中在WAT的血浆/血清或脂质体组分析上。而我们对分析WAT微环境中可能影响其表型的局部极性代谢物很感兴趣。最近已在四个瘦人的样本中对WAT分泌的嘌呤代谢物进行了有针对性的研究。与该研究一致，我们发现WAT分泌的次黄嘌呤和黄嘌呤在肥胖和非肥胖个体之间的差异显著(图1A)。在我们研究的81名非肥胖和肥胖个体中，谷氨酰胺释放的差异最为显著，且与体脂肪百分比和脂肪细胞体积相关，而与体重指数无关。谷氨酰胺是机体必需的，也是机体内最丰富的氨基酸。它作为三羧酸循环的能量底物参与中心代谢过程，并在嘌呤/嘧啶合成、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸代谢和尿素循环中作为氮供体。已有研究报道了谷氨酰胺对从危重疾病到代谢综合征和2型糖尿病等众多疾病的临床潜力。据报道，即使是单剂量的谷氨酰胺也有可测量的生理效应，如对GLP-1和胰岛素分泌的影响。此外，在饮食诱导肥胖的小鼠模型中，长期补充谷氨酰胺可以改善葡萄糖代谢，但也会导致体重减轻，这使得很难明确其主要机制。
谷氨酰胺循环水平、体重和代谢健康之间的联系已得到了许多独立的研究结果支持，这些研究结果表明，低谷氨酰胺水平可以预测以大量人群为基础的人群2型糖尿病的发病率。在我们的队列(队列1)中发现WAT谷氨酰胺释放水平与血清水平之间没有相关性，这可能是因为WAT是血浆中谷氨酰胺的一个较小的贡献者。此外，在我们的研究中，WAT活检是在一夜禁食后进行的，这已被证明可以诱导肌肉中的谷氨酰胺合成酶水平增加。因此，我们不能排除我们的实验设计可能掩盖了谷氨酰胺循环的一个更重要的贡献者。然而，肥胖引起的局部谷氨酰胺水平的变化促使我们研究WAT中谷氨酰胺代谢和转运相关基因的表达。转录组分析显示GLUL是肥胖患者谷氨酰胺通路中最显著的异常基因。虽然GLUL在脂肪细胞中基因表达水平较高，但在肥胖人群的整体WAT（包含所有细胞类型）中GLUL表达水平均较低。这表明脂肪谷氨酰胺释放的差异依赖于几种常驻细胞类型的贡献。转录组分析显示，GLUL和参与促炎过程的基因之间存在很强的负相关，这一联系在蛋白水平上通过WAT中GLUL和促炎脂肪素分泌之间的负相关得到证实。
在小鼠小胶质细胞、T细胞和巨噬细胞，以及小鼠细胞系分化的脂肪细胞中，GLUL介导的谷氨酰胺产生抗炎作用已经被报道。然而，据我们所知，谷氨酰胺对小鼠或人类WAT炎症的影响尚未被研究。为了探讨谷氨酰胺对WAT体内炎症的影响，我们给正常饲养的小鼠腹腔注射谷氨酰胺。我们选择这种方法是为了避免先前报道的谷氨酰胺诱导的体重减轻的混淆效应，以及口服给药对肠促胰岛素释放和肠道微生物群组成的影响。在这个短期干预中，许多促炎基因的表达被减弱而不影响任何代谢参数，这鼓励我们在HFD模型中进行扩展研究。这种干预不影响能量消耗和呼吸交换率，只对WAT大小和脂肪细胞体积产生很小的影响，但证实了谷氨酰胺抑制WAT中促炎基因表达、F4/80染色和M1巨噬细胞比例正常化。在这些动物中也观察到空腹血糖和胰岛素的降低，但对糖耐量没有影响。虽然这可能表明谷氨酰胺对整体葡萄糖代谢的影响不大，但也可能是由于干预时间相对较短(2周)导致。综合来看，谷氨酰胺对WAT炎症有直接影响，这可能有助于解释长期补充谷氨酰胺的有益代谢作用。在体外分化的人脂肪细胞中，我们证实了谷氨酰胺对促炎基因的表达具有浓度和时间依赖性。虽然这与对分化的影响无关，但在高谷氨酰胺培养的细胞中可以观察到脂滴变小。这一观察结果与其临床相关性结果以及对小鼠体内脂肪细胞大小的影响相一致，并提示谷氨酰胺可诱导代谢变化，减轻脂质积累和脂肪细胞肥大。
目前已经报道了几种谷氨酰胺与炎症的联系机制。在Caco-2/TC7肠上皮细胞系中，核NF-kB降解部分解释了谷氨酰胺与炎症的联系。在巨噬细胞和T细胞中，据报道谷氨酰胺与炎症的联系是通过能量利用的转移(即糖酵解与谷氨酰胺分解的平衡)来介导的，从而改变中间代谢物如酮戊二酸或UDP-GlcNAc的水平。这两种代谢物已被证明可作为控制DNA/组蛋白去甲基化或蛋白O-GlcNAc糖基化的共底物(α-酮戊二酸)或底物(UDP-GlcNAc)来调节细胞表型。在此，我们证明了高谷氨酰胺水平减弱糖酵解，导致UDP-GlcNAc水平和O-GlcNAc糖基化减少。相反，在α-酮戊二酸水平或组蛋白甲基化方面没有观察到差异，并且人类脂肪细胞与α-酮戊二酸共孵育并不影响炎症基因的表达。谷氨酰胺调节的O-GlcNAc糖基化与人脂肪细胞中促炎性脂肪因子分泌之间的因果关系通过几种不同的方法得到了证实，包括OGT敲除和OGT或OGA的药理抑制。然而，正如下面进一步讨论的，我们的数据表明谷氨酰胺也可能通过其他机制调节炎症。
为了深入了解人类脂肪细胞中O-GlcNAc糖基化的功能，我们对核O-GlcNAc糖基化蛋白进行了蛋白质组学分析，鉴定了数百种参与染色质重塑、RNA加工和核糖体生物发生和运输的蛋白，确定了O-GlcNAc糖基化在染色质重塑中的作用。组蛋白和转录因子/辅助因子上的O-GlcNAc糖基化修饰既可以激活转录活性，也可以抑制转录活性。此外，非脂肪细胞系中核糖蛋白的O-GlcNAc糖基化已被报道，但需要在脂肪细胞中做进一步研究。由于剪接体的O-GlcNAc糖基化尚未被报道，我们的数据可以用来研究O-GlcNAc糖基化和细胞过程之间的联系。然而，确定各O-GlcNAc糖基化蛋白簇对脂肪表型的贡献超出了本研究的范围。尽管如此，我们通过O-GlcNAc糖基化蛋白质组沿着染色质的空间分布可绘制出受谷氨酰胺介导的O-GlcNAc糖基化影响的目标区域。这些数据证实了O-GlcNAc糖基化和炎症之间的联系。生物信息学方法发现了连接O-GlcNAc糖基化与炎症的转录因子SP1，它已在之前WAT炎症中被证实。此外，有报道称，SP1的O-GlcNAc糖基化作用通过影响其稳定性、核易位和转录活性对其功能产生深远影响，导致小鼠3T3-F442a脂肪细胞中细胞因子表达的改变。在人类脂肪细胞中，谷氨酰胺介导的IL1B和IL6表达减少并不涉及O-GlcNAc糖基化差异和/或SP1与其启动子的结合，而是间接调控其他基因。生物信息学分析确定了谷氨酰胺、O-GlcNAc糖基化和SP1与炎症相关的基因的联系，并通过验证实验证实。然而，必须强调的是，SP1的O-GlcNAc糖基化降低只是机制之一，广泛的O-GlcNAc糖基化蛋白组学提示谷氨酰胺调控的O-GlcNAc糖基化可能通过其他机制影响促炎基因的表达。
尽管WAT炎症与代谢功能异常密切相关，但针对炎症过程的疗法尚未成功治疗胰岛素抵抗或2型糖尿病。虽然这可能取决于多种机制，但我们的结果揭示了炎症在WAT中的作用。因此，炎症的短暂激活是WAT扩张的必要条件，而抑制这些途径可能实际上是有害的。这表明炎症和代谢性疾病之间的联系是动态的、与环境相关的。我们的研究还表明，WAT感知到局部的代谢状态，从而导致炎症反应，使组织重塑成为可能。考虑到局部谷氨酰胺水平/GLUL表达与脂肪细胞体积之间的强相关性，我们可以推测脂肪细胞体积的增加是通过降低局部谷氨酰胺水平瞬时激活炎症来实现。一旦达到能量稳态，局部谷氨酰胺水平重新恢复正常，但在恒定的热量供应过剩的情况下，例如肥胖，局部谷氨酰胺水平难以恢复正常，炎症持续被激活。
结论
本研究报道了肥胖个体的WAT内谷氨酰胺代谢紊乱，且与恶性WAT表型相关。谷氨酰胺水平的降低使能量消耗平衡从谷氨酰胺分解转向糖酵解，导致核蛋白O-GlcNAc糖基化，激活炎症（如图8所示）。未来的研究需要探究这种免疫代谢串扰的动力学及其潜在的治疗影响。
图8 谷氨酰胺是肥胖与人白色脂肪组织炎症间的枢纽