科研 | 中科院南土所Soil Biol Biochem：在含水量不同的土壤生境中存在不同的甲烷氧化菌群落
编译：厚朴，编辑：小菌菌、江舜尧。
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在自然的生态系统中好氧的甲烷氧化细菌通过减少甲烷的排放在控制全球气候方面扮演着重要的角色。本研究从青海西藏高原三种生境（高寒草甸、沼泽草甸和沼泽）中研究了土壤甲烷氧化菌的群落聚集过程和共生交互作用。在不同的生境中甲烷氧化菌群落和甲烷氧化潜势十分不同，并且甲烷氧化菌的多样性在沼泽中显著低于其它两种土壤中的。甲烷氧化细菌的多样性与土壤可溶性有机碳（DOC），pH，总碳（TC），和总氮（TN）显著相关，然而甲烷氧化菌群落结构与土壤C/N，TC，土壤湿度以及TN显著相关。在甲烷氧化菌群落的聚集过程中随机性占主动，从高寒草甸的67.6%和沼泽草甸的68%增加到沼泽的98.2%。在高寒草甸网络的自然连接性高于其他两种生境，表明在高寒草甸有一个更稳定的网络。甲烷氧化菌的多样性是导致子网络拓扑差异的重要原因，确定的关键物种有USCγ, Methylobacter和RPC-1。这些结果表明土壤甲烷氧化菌不同的群落聚集过程和共生格局在不同的生境中是不同的，这可能会提高我们对控制甲烷氧化速率因子的理解。
论文ID
原名：Distinct methanotrophic communities exist in habitats with different soil water contents
译名：在含水量不同的土壤生境中存在不同的甲烷氧化菌群落
期刊：Soil Biology and Biochemistry
IF：5.795
发表时间：2020
通讯作者：褚海燕
作者单位：中国科学院大学南京土壤研究所
实验设计
在青藏高原（QTP）东北部的一个山谷中，在高寒草甸、沼泽草甸和沼泽地上建立了三个样带。这一地区（约10平方公里亚区）代表着世界上最大的高海拔（约3200米）和低纬度多年冻土区。山谷的年平均温度约为-2℃，年平均降雨量约为500mm。该地区以草甸植被为主，还包括高寒草甸、沼泽草甸和沼泽。土壤类型为高寒草甸中的席状寒武土、沼泽草甸中的莫尔晶寒武土和沼泽地的有机结晶潜育土，土壤质地分别为粉质粘土、壤土和壤土。
在2016年的8月26日进行土壤取样。在三种生境，三条样带中总共采集了45份土壤样品。在每条样带中，从0-10厘米土壤层中采集了15份样品。土壤样品分成三部分：第一部分储藏在4℃用于测定土壤物理化学属性；第二部分风干并且过2mm筛用于培养实验；最后一份储藏在-40℃，用于DNA的提取。测定的指标有土壤pH，土壤含水量，WFPS%，总碳（TC），总氮（TN），可溶性有机氮（DON）以及可溶性有机碳（DOC）。
在培养之前，土壤调到60%的田间持水量，并且在28℃的黑暗环境中以及环境空气条件下培养4天。然后将预培养的土壤等分（5g，湿重）放入带有丁基橡胶塞的120ml血清瓶中，并且将甲烷注入到小瓶的顶部空间，得到2%的最终混合比。准备三份，并且使用无土壤的对照血清瓶来确认是否存在气体泄漏。每天从瓶口获得的1ml气体，使用带有火焰离子化检测器的气相色谱仪测定甲烷的浓度。培养初期甲烷浓度开始立即下降。根据甲烷氧化和培养时间的线性回归方程的斜率来确定潜在的甲烷氧化速率。
对新鲜的土壤样品进行DNA的提取，然后进行pmoA基因的定量以及454焦磷酸测序分析。PmoA基因扩增的引物为A189F/mb661r。从45份土壤中一共获得274405条测序序列。在BLAST 2.7.1进行pmoA基因的物种注释。使用FastTree软件构建系统发育树。
使用SPSS 23.0 进行方差分析，评估不同生境中土壤物理化学属性，甲烷氧化潜势和基因拷贝数之间的差异。使用R 3.4.1的vegan包进行非度量多维标度（NMDS），Simper分析，Mantel检验，部分Mantel检验和成对比较（ADONIS，ANOSIM和MRPP）。使用加权的Unifrac和未加权的Unifrac距离评估系统发育的差异性，并且使用QIIME脚本计算。使用R 3.4.1的plspm包中的“inner plot”函数构建偏最小二乘路径模型（PLS-PM）。此外，本研究使用基于距离矩阵（MRM）的多元回归分析测量了土壤物理化学属性，甲烷氧化潜势和甲烷氧化菌多样性对群落结构解释的方差相对大小。R 3.4.1的ecodist包进行MRM分析。
为了确定驱动样本内群落组成的集合过程，本研究计算了每个样本最近的分类单元指数（NT1）值和成对样本的β最近的分类单元指数（βNT1）。使用picante包进行NT1值的计算，使用phylocom 4.2 中的comdist方程进行βNT1值的计算。如果NT1的值是正的并且均值大于0（P<0.05），那么共生物种受系统发育聚类的影响大于过度分散的影响；相反地，为负值并且均值小于0（P>0.95）表明共生的物种主要受过度分散的影响（Webb, 2000）。如果βNT1的值大于2或者小于2，在形成群落组成的过程中确定性的过程是关键的，然而如果βNT1的值位于-2到2之间，随机的过程更重要（Stegen et al., 2012）。为了进一步量化随机差异，本研究使用扩展的Raup-Crick度量来估计成对的群落周转，以整合到物种的相对丰度（RCbray）。没有偏离零模型分布的群落间的两两比较被评估为扩散限制（|βNTI|<2和RCbray> +0.95）和均匀化扩散（|βNTI|<2和RCbray< -0.95）的贡献；RCbray值介于-0.95和+0.95之间，表明给定的一对群落之间的组成周转是“不确定的”。
结果
1 土壤化学属性和甲烷氧化活性
三个生境的土壤化学性质存在显著差异。在沼泽（265 ± 83%）土壤中的土壤湿度显著高于草甸沼泽（211 ± 48%）和高寒草甸（48 ± 6%）。WFPS在沼泽，沼泽草甸和高寒草甸分别是84.91%，80.38%和54.23%。土壤DOC，TC和TN在沼泽草甸中显著高于高寒草甸和沼泽。土壤C/N比和DON在沼泽中显著高于高寒草甸和沼泽草甸中的。土壤pH在三种生境中没有显著差异。潜在的甲烷氧化速率在沼泽草甸中显著高于高寒草甸和沼泽土壤中的。pmoA基因拷贝数在沼泽土壤中的显著高于高寒草甸和沼泽草甸中的。
2 在高寒草甸，沼泽草甸和沼泽中甲烷氧化菌群落组成的变异
土壤甲烷氧化菌群落组成在高寒草甸，沼泽草甸和沼泽之间不同（图1）。甲烷氧化菌属根据他们的系统发育分类分成5组。Type Ib，type IIa和type Ia甲烷氧化菌在群落中占优势，并且在所有的样品中分别占69.5%，69.8%和43.9%。USCγ (type Ib)在高寒草甸中是优势种，并且占甲烷氧化菌群落的66.3%，但是在沼泽草甸（0.1%）和沼泽（0.02%）中的比例稀少。Methylocystis (type IIa) 在沼泽草甸（69.7%）中的相对丰度高于高寒草甸（4.7%）和沼泽（18%）。在沼泽，Methylobacter，FWs和Methylocystis是优势物种（图1）。RPC-1 (type Ib) 相对于高寒草甸（0.4%），在沼泽草甸（7.9%）和沼泽（7.6%）中比例相对较高。相反地，Methylosarcina (Type Ia) 在高寒草甸（3.7%）中的相对丰度高于沼泽草甸（1.2%）和沼泽（0.4%）。
3 甲烷氧化潜势，土壤甲烷氧化菌多样性和群落结构的环境驱动因子
甲烷氧化潜势和pmoA基因拷贝数在所有的土壤样品中与土壤C/N正相关，并且随着土壤从干旱到湿润逐渐增加。相对于高寒草甸和沼泽，群落多样性在沼泽草甸中最低（图2A-C），并且在所有的样带中几乎没有差异。NMDS证明了土壤甲烷氧化菌群落在不同的生境中存在差异（图2D），并且被Simper分析进一步证明。在每组比较中群落非相似性显著不同，并且被基于Bray-Curtis 距离的ADONIS，ANOSIM和MRPP分析进一步确定。
与其他因子相比较，土壤DOC与土壤甲烷氧化菌多样性的负相关程度最大。基于地理距离的群落相似性和系统发育相似性与环境的非相似性的Mantel检验，结果表明环境变量在形成群落相似性和系统发育相似性上扮演重要角色。在去除地理距离的影响，partial Mantel 检验的结果表明环境因子与甲烷氧化菌群落相似性和系统发育相似性显著相关。环境变量在形成群落相似性和系统发育相似性上扮演着重要的角色，尤其是在沼泽草甸和沼泽。此外，当去除环境距离影响的时候，地理距离和甲烷氧化菌群落的非相似性高度相关。PLS-PM和MRM分析用来揭示影响甲烷氧化菌群落结构的潜在的路径，包括物理化学属性，甲烷氧化潜势和土壤甲烷氧化菌α多样性（图3A-C）。在保留最显著的变量后，PLS路径模型解释了89%的群落变异。土壤参数对甲烷氧化菌群落的直接影响强于甲烷氧化潜势和土壤甲烷氧化菌α多样性的直接影响（图3A）。在环境变量中，土壤C/N有最高的解释变异（0.54）（图3C），表明土壤C/N在解释甲烷氧化菌群落结构上是关键的驱动因子。
4 量化生态过程对形成甲烷氧化菌群落结构的影响
总体而言，在所有生境和样带中NT1的均值大于零，表明甲烷氧化菌群落在系统发育关系上是聚类的。βNT1矩阵的值在-2到2之间，表明随机的过程主要控制着甲烷氧化菌群落动态，相对于沼泽（98.2%），随机过程的相对贡献在高寒草甸（67.6%）和沼泽草甸（68%）中较低（图4A和B）。在三种生境中随机过程存在差异。在高寒草甸（74.3%）和沼泽（77.9%）组成成分的周转不占优势；在高寒草甸有相对较高的扩散限制，然而在沼泽草甸和沼泽中没有检测到扩散限制；然而，在沼泽和沼泽草甸中均匀扩散的速率较高，然而在高寒草甸中没有发现均匀扩散（图4C）。此外，沼泽土壤中高寒草甸和沼泽草甸的βNTI测量值显著低于沼泽土壤（P<0.001，方差分析），这两个生境具有一定比例的确定性过程（分别为32.4%、32.0%）。为了评价环境变量对βNTI的相对影响，对βNTI指标与环境因子进行了Mantel检验。在环境变量中，系统发育零偏差主要与DOC的变化相关。这说明土壤DOC的过滤作用（如增加或减少土壤DOC的变异）可能会引起不同地点系统发育结构模式的紊乱，从而导致地点内甲烷营养群落系统发育的保护。
5 在高寒草甸，沼泽草甸以及沼泽中共生甲烷氧化菌群落的拓扑属性和关键物种
为了描述和评价各生境中甲烷氧化菌群落的共生相互作用，本研究构建了共生网络，并计算了网络和子网络的拓扑性质。考虑到相关性的数量，本研究发现在所有的生境中都以正相关为主，这表明甲烷氧化菌表现出合作关系而不是竞争关系。与沼泽草甸和沼泽相比，高寒草甸具有最高的节点连接性（平均度为10.346）和最高的平均路径长度（1.64）。网络直径呈现相似的趋势，在高寒草甸（7边）达到峰值，在沼泽（3边）观测到最小值。度分布的拓扑格局表明，pmoA基因在三种生境中均呈典型的幂律分布，表现为无标度网络结构，而不是随机共生模式。在比较三种生境的网络稳定性时，自然连通性带来的波动较小在高寒草甸（图5B）中观察到了与移除节点比例相关的模式，这表明网络拓扑更加稳定。
进一步为每个土壤样本生成子网络，通过保持OTUs与特定样本以及它们之间的所有边缘关联在每个栖息地的共现网络中。基于层次聚类分析，计算了若干子网级拓扑特征，并将其分为三类。聚类1包括节点数、边缘数、全局聚类系数和平均聚类系数。聚类2包括边缘密度和集中度。聚类3包括聚类、特征向量集中、模块化和中间性集中。在评估了它们与环境变量的相关性后，本研究发现，与集群中其他拓扑特征类似的边缘数，如节点数、全局聚类系数和平均聚类系数，与土壤甲烷菌α多样性呈正相关，沼泽地的相关系数低于其他两个生境。聚类2的边缘密度和集中度与土壤甲烷菌α多样性呈负相关。此外，群落多样性、聚类度和特征向量与多样性呈正相关。沼泽草甸和沼泽中的中间集中度与甲烷菌α多样性呈负相关。
OTU间的Zi-Pi关系表明，在所有生境中，大多数节点是外围节点，每个生境中只有少数节点是连接节点，而没有模块中心点或网络中心点。本研究将连接点作为网络中的关键物种。在高寒草甸Methylobacter和USCγ是连接节点。与高寒草甸和沼泽草甸相比，沼泽草甸中作为连接节点的低丰度OTU相对较多，例如OTU 3746、OTU 2909、OTU 962、OTU 6544、OTU 3608（均归属于USCγ）和OTU 3154（分配给RPC-1）。OTU 6431（分配给Methylobacter）和OTU 3149（未分类的甲烷菌）被检测为沼泽网络中的连接节点（图6）。
讨论
1 潜在的甲烷氧化速率和不同的类群土壤甲烷氧化菌
土壤潜在的甲烷氧化主要发生在土壤-水截面。因此，甲烷氧化潜势在沼泽草甸中和沼泽中较高寒草甸中的要高，这与之前研究的结果一致。甲烷氧化潜势与土壤C/N和土壤湿度正相关，这与一些研究的结果也一致。在本研究中，土壤重力含水量从高寒草甸（48%），沼泽草甸（211%）到沼泽（265%）呈增加的趋势，这与显著增加的土壤甲烷氧化活性相关联。土壤结构和土壤空隙系统影响水的范围和气体通量。高水位会使得环境更加缺氧，从而会导致甲烷氧化菌的活性高，有利于氧截面附近的好氧的甲烷氧化菌。
本研究表明甲烷氧化菌群落在具有不同土壤理化性质的三种生境中显著不同。Methylocystis属的一些物种，II型的甲烷氧化菌，据一些研究报道其对甲烷有相对较高的亲和性。在本研究中，在沼泽草甸中发现高丰度的Methylocystis。高丰度的Methylocystis在不同的北方泥炭地中也有过报道。显而易见的，在高寒草甸中检测出了非常高的USCγ（66.3%）丰度。这种分类群在旱地土壤中更容易检测到，其消耗大气中的甲烷并且pH值大于6。FWs，一种不能培养的系统发育聚类，在沼泽中富集。这一类群，在植物收获湿地发现的，其在全球甲烷循环过程中扮演着重要的角色（Zhu et al., 2007）。
2 在小的尺度上环境因子而不是地理距离形成了土壤甲烷氧化菌群落相似性和系统发育相似性
在所有的土壤样品中土壤DOC，TC和TN与甲烷氧化菌多样性负相关，土壤pH与甲烷氧化菌多样性正相关。这些结果表明甲烷氧化菌对特定的环境有特殊的适应能力，底物的有效性会选择I型和II型的甲烷氧化菌并且限制它们的生长。土壤C/N，TC，TN和土壤湿度是不同群落结构的主要驱动因子。此外，本研究发现，环境因子在形成土壤甲烷氧化群落结构上扮演着关键的角色，而地理距离在确定甲烷氧化菌群落上扮演相对较小的角色。这或许是因为三种生境位于一个相对较小的空间尺度。为了比较，在未来的研究中，应该考虑在更大的空间尺度上进行取样。
3 随机过程控制着甲烷氧化菌群落的聚集
当环境异质性或者物种分类较低时，随机过程可以极大地影响微生物群落组成。在本研究中，βNT1的值在-2到2之间，表明随机的过程形成了甲烷氧化菌群落的聚集，这与Shi 等（2018）在QTP的研究结果一致，即在小于130 km的尺度上随机可能会超过确定性过程。尽管如此，与沼泽相比，高寒草甸（相对贡献率为32.4%）和沼泽草甸（相对贡献率为32%）存在一些确定性过程。尽管随机性的比例与水分梯度保持一致，但是这些结果可能表明甲烷氧化菌群落组成在不同的生境中不同，哪一个会被选择成为特定的分类群（例如，USCγ氧化大气中的甲烷）。本研究存在缺陷，在空间和时间上考虑土壤中甲烷氧化菌的相对比例是重要的。在未来需要更多的研究来阐明沿着环境梯度或者跨越时空选择的密切相关分类群的生态位。了解这种随机变化是否会对甲烷氧化潜势产生微尺度空间变异的影响是件很有趣的事。
4 I型甲烷氧化菌对共生的网络中心的稳定性更为重要
在三种生境中甲烷氧化菌的网络都呈幂律分布。呈现幂律分布的网络有许多的节点，只有很少的连结，并且存在一些高度连结的节点，被称为连接节点。由于共生模式与生态系统中微生物之间的相互作用有关，驱动微生物网络拓扑特征的因素可以反映它们对微生物相互作用的影响。高寒草甸、沼泽草甸和沼泽网络的环境驱动力各不相同。总的来说，土壤中甲烷菌的α多样性比土壤理化变量对子网络结构的影响更为重要，这表明土壤甲烷菌多样性与甲烷营养相互作用直接相关。pH和土壤C/N分别与高寒草甸和沼泽地子网络拓扑特性显著相关。这些相关性可能为理解CH4-氧化物种间相互作用在影响元素循环中的重要性提供了一些见解，而元素循环也可能受到地下水位变化的影响。从Zi-Pi空间，本研究认为I型甲烷菌（如Methylobacter、USCγ、RPC-1）是网络连接节点，可能在群落合作中起关键作用，并对共生网络的稳定性产生显著影响。事实上，一些研究表明，I型甲烷氧化菌在多年冻土湿地中非常活跃，它们在低亲和力甲烷氧化中的作用在不同土壤中是不同的。
结论
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