机械通气患者的呼吸道微生物组学：一项描述性综述
摘要
呼吸道微生物组学的研究明显少于肠道微生物组学。尽管在呼吸机相关性肺炎（VAP）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）中呼吸道菌群失调具有重要意义，但重症监护室机械通气患者中气道菌群的研究却很少。部分研究发现下呼吸道和口咽道的细菌种群之间存在交叉重叠；且菌群相对丰富的细菌难以通过标准方法进行培养。
在机械通气条件下，呼吸道微生物多样性随着通气时间延长而降低。在VAP发生过程中，呼吸道微生物生态失调，其特征是菌群向占主导地位的细菌病原体转移（主要是变形杆菌），而肠道相关细菌的富集（主要是肠杆菌科）是区分ARDS患者的典型特征。但这种生态失调在VAP和ARDS发病机制中的作用尚不明确。
对细菌、病毒和真菌之间相互作用的深入分析以及对宿主-微生物相互作用的深入理解，可以更全面的了解微生物组学在VAP和ARDS发病机制中的作用。
本文就关于机械通气患者呼吸道微生物研究的现状、应用前景以及潜在临床应用价值作描述性综述。
介绍
由于传统检测方法较差的敏感性，一直认为肺是无菌的。但是随着非传统培养技术的发展，特别是高通量测序，这一理念受到挑战。许多微生物包括细菌、病毒和真菌，共存于健康人的肺中，构成呼吸道微生物群。即使目前使用了16S rRNA基因测序技术，但对肺部微生物群的研究还局限于单一的细菌微生物群阶段。
同慢性呼吸系统疾病相比，在重症监护医学领域的相关研究尚处于起步阶段，但是同肠道菌群失调一样，呼吸道微生物群与宿主的相互作用以及失调也极有可能在慢性炎症性疾病（如哮喘）、慢性阻塞性肺疾病（COPD）和囊性纤维化疾病的病理生理学机制中起关键作用。
此外，目前并没有研究关注机械通气患者真菌菌群或病毒组方面的演变规律，而肺中真菌定植和病毒复制在这一人群中广泛存在。因此，阐释全肺微生物组学（包括细菌、真菌和病毒）的动态演变是呼吸学的主要挑战之一，以重新定义我们对呼吸机相关肺炎（VAP）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）病理生理机制的理解。
本综述的目的是明确微生物组学研究中使用的主要定义和术语，介绍重症医学中呼吸道微生物组学的最新知识，并介绍目前使用的技术及各自局限性。并通过对呼吸道微生物组学以及其演变规律更深入的理解，为未来更多的研究项目奠定基础，以更好的对急性肺损伤进行预防、诊断和治疗，特别是ARDS和VAP。
肺细菌组群
细菌微生物组群代表培养基中所有细菌成分。从域到种分类的细菌分类学用于描述细菌微生物群（图1以铜绿假单胞菌为例）。
人的肺部微生物组群可以利用下呼吸道分泌物样本进行研究。最近的研究表明，健康人口咽部和下呼吸道的微生物组群组成相似，而所有慢性呼系统疾病（COPD和间质性肺疾病，如特发性肺纤维化）的上、下呼吸道的微生物群组组成却不同；目前暂没有急性肺炎患者口咽和肺部微生物组群的公开报道数据。
在重症医学科，支气管肺泡灌洗（BAL）比气管内抽吸（ETA）收集下呼吸道分泌物更为常用。然而，据我们所知，没有研究比较这两种取样方法的优劣。因此，无法给出优先选择的明确建议。
下呼吸道微生物群的主要特点是密度低，根据传统微生物学研究方法的评估，每毫升约有105个菌落单位形成。这相当于每克组织中105个细菌的生物量。尽管密度很低，但却观察到很高的多样性，这构成了呼吸道健康的生物标志物。在这种多样性中，发现大多数健康个体中存在的一组细菌物种，代表肺部的“核心微生物群”。这种核心微生物群主要由普氏菌属、链球菌属、维氏菌属、梭杆菌属和嗜血杆菌属组成。
对于单个体而言，肺部微生物群的组成均来源于这个核心微生物群，是上呼吸道微生物扩散和宿主防御消除微生物之间平衡的结果。同肠道微生物群一样，肺部微生物群的组成可能是由许多内源性因素共同形成的，比如粘液产生和固有免疫机制，但也有外源性因素，如环境多样性。
与细菌微生物群一样，真菌微生物群代表了一个生态系统或其样本中的所有真菌物种。真菌基因组在真菌界中也包含高度保守的序列，这些序列框定了高变区，允许对其进行鉴定。
人类病毒组对应于培养基中所有DNA和RNA病毒的基因组。它包括两大实体：真核病毒和原核病毒（噬菌体）。与细菌和真菌不同的是，人类病毒界没有保存基因组序列，只有病毒组可以研究，这就需要对样本中的所有核酸序列进行深度测序，以分析病毒组群。
在高通量测序领域取得的进展使人们能够在不依赖传统培养技术的情况下，深入研究生物多样性和生物多样性。规定了明确了解这一专业领域所需的定义。呼吸道微生物组群分析方法的一般原则，包括微生物组、真菌组和病毒组见图2；其局限性见在线补充材料。
图3示：随时间推进的实例说明微生物演变α和β多样性概念。
重症监护病房（ICU）肺部细菌菌群
肺部微生物群与机械通气
迄今为止，大多数关于呼吸道微生物群的研究都是在哮喘、慢性阻塞性肺病和囊性纤维化等慢性呼吸系统疾病患者中进行的。研究似乎表明：（1）每种慢性呼吸系统疾病都与不同的微生物群特征有关；（2）菌群失调的严重程度与临床状况之间存在关联性。只有少数描述性研究在重症监护病房进行，其中一项从机械通气并且明确铜绿假单胞菌定植的患者中收集微生物的研究表明，ETA中的微生物种群极其多样。
Bousbia等人还观察到，在机械通通气中的社区获得性肺炎（CAP）或VAP患者中， 收集的BAL标本中存在重要的细菌多样性。共鉴定出7门146种细菌，其中73种从未在肺炎患者中被描述过。随后，Smith等人特别关注了15名未感染的机械通气患者的肺微生物群，这些患者通过传统微生物检测方法测定BAL阴性。共鉴定出3个菌门，主要为厚壁菌门、拟杆菌门和变形杆菌门。大多数患者具有高度的α多样性（给定个体样本中的物种多样性）。个体间变异主要是在属水平上描述的。然而，在机械通气过程中气道微生物群的动态演化问题，这可能是最相关的研究，刚刚在最近的两个研究中得到解决。
2016年，Kelly等人报告，与对照组（健康、未通气受试者）相比，插管后α多样性迅速下降，随着机械通气时间的延长，α多样性逐渐下降。与对照组相比，机械通气患者的微生物群分布也显示出更多的个体差异（β多样性更高）。这主要是由于单一操作分类单位（OTU）在机械通气患者中占主导地位。同样观察35名机械通气患者，对111份样本进行了分析。在这个人群中，α多样性随着机械通气时间的延长而减少，有趣的是，抗生素对气道微生物群的演变没有影响。但是最近Emonet等人缺未能观察到VAP患者与对照组相比在两个时间点（插管当天和后续标本）之间个体差异的显著变化。
除了机械通气对肺部微生物群的特殊影响外，ARDS或严重全身炎症反应综合征（SIRS）可直接或通过肠道微生物群的富集对其成分产生影响。只有少数临床前研究对危重患者的这些方面进行了研究，但肠道和肺部微生物组群之间的关系在哮喘或囊性纤维化疾病中得到了良好的描述，被称为“肠-肺”轴。
在小鼠败血症模型中，Dickson等人报告了肠道细菌在肺部微生物群中的富集，包括类杆菌目、肠球菌种和毛螺菌种。研究认为“在实验性脓毒症后，肺部微生物群发生改变，至少5天内保持改变，2周后恢复正常”。在68例ARDS患者的BAL样本中，33%的病例出现类杆菌，而健康对照组只有3%。同一作者在最近对91例机械通气患者的研究中发现，肺部微生物群中的肠道相关细菌与ARDS的发生有关。因此，他们提出了肠道微生物组群在这两种常见危重疾病中所起的潜在尚未确定的共同机制。另外两项研究表明，与对照组相比，ARDS患者的α多样性降低。然而，ARDS患者肺部微生物群的高度异质性不允许特定的个体化。
总而言之，目前仍需可对比的方法进行进一步的研究，以更好地描述不同因素在微生物生态失调、炎症和肺损伤的恶性循环中的作用，并确定肠道细菌富集对肺微生物群的真实作用和影响。
在急性肺部感染，尤其是在机械通气患者中，肺部细菌微生物群很少受到关注。2007年，Flanagan等首次对已明确呼吸道定植铜绿假单胞菌的机械通气患者ETA中的16S rRNA基因进行测序。发现最常见的细菌属于三个主要门：厚壁菌门、拟杆菌门和变形杆菌门，与口咽、鼻和胃肠道的菌群中其他数量较少的菌种（如乳酸杆菌、肠球菌和静脉内耳菌）有关。抗生素治疗与微生物群多样性和铜绿假单胞菌占优势有关。因为本研究选择的对象是定植菌患者，所以口咽和消化道微生物群可能是定植细菌的来源，这些细菌在机械通气期间会引起微生物生态失调。
Zakharkina等人比较了机械通气患者呼吸道微生物群的演变，无论他们是否发生VAP。与未发生VAP的机械通气患者相比，发生VAP的患者中细菌群的更大异质性解释了其β多样性显著增加的原因。似乎可以产生一个概念，VAP的责任细菌代表了主要的OUT（本研究中主要指金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和假单胞菌属）将减少其他细菌菌落数。根据这些研究的结果，我们还可以假设一些非致病性菌种对VAP的发生具有保护性屏障作用。
呼吸道微生物群风险标志物的识别可能是更需要关注的问题。Emonet等尝试在插管期间早期鉴别VAP的亚分类标记物，他们发现VAP患者和对照组患者在任何时间点的ETA样本中微生物群都没有显著变化。然而，VAP患者的ETA在VAP前3天含有较多的丙种变形杆菌类（假单胞菌属，肠杆菌科），而在经口气管插管后含有较少的杆菌类（肠球菌属，链球菌属，乳酸杆菌属和葡萄球菌属）。作者试图利用这一差异对VAP组和对照组的患者进行分类，但他们的结果尚未得到证实。
肺真菌区系
最近有一些研究利用高通量测序来评估肺真菌生物群。对健康人肺真菌群的研究发现，许多环境真菌包括曲霉属、霉菌（青霉属和枝孢属）和酵母菌，属于两个主要的子囊菌门（念珠菌门）和担子菌门（马拉色菌门）。真菌菌群失调及其与肺部疾病的相关性研究尚处于起步阶段。
在大多数培养基中，细菌和真菌群落之间存在着相互作用，其中一个菌群的演变会导致另一个菌落的改变。机械通气患者中，在数日机械通气后，一些酵母菌，特别是气道定植的念珠菌属，在25%到50%的患者中可以发现。这种定植与细菌性肺部感染的发生有关。因此，即使真菌、细菌和宿主之间相互作用的确切机制仍不清楚，细菌与真菌的相互作用在VAP的发病机制中仍起着重要作用。在一项为期4年的危重病患者多中心研究中，214例（26%）呼吸道定植患者与214例未暴露患者进行匹配和比较。支气管念珠菌定植是假单胞菌肺炎的独立危险因素（9 vs 4,8%），校正比值比（aOR）=2.22[1,00；4,92]（p=0.049），但对死亡率无影响。一种可能机制是白念珠菌引起的细菌吞噬功能的改变。
Roux等人在大鼠中发现，白色念珠菌气道定植引起Th1-Th17免疫反应，通过抑制肺泡巨噬细胞的细菌吞噬作用促进细菌性肺炎的发展。他们还表明，在体外，白色念珠菌阻碍肺泡巨噬细胞活性氧的产生，并在体内与大鼠铜绿假单胞菌肺炎发病率的增加相关。Tan等人表明，同样的白色念珠菌定植有利于大鼠鲍曼不动杆菌肺炎。同一研究小组还发现，在机械通气的ICU患者中，念珠菌气道定植是鲍曼不动杆菌VAP的独立危险因素。
目前只有两项研究专门针对ICU中真菌性肺炎的。Bousbia等人在对31名肺炎患者和6名对照者进行的开创性研究中，确定了22种真菌，属于2个门：子囊菌门和担子菌门。未观察到真菌生物群与细菌种类之间的特殊联系。在Krause等人关于重症监护病房患者的真菌生物群的研究中，观察到每一个有肺炎的机械通气患者的真菌多样性下降。假丝酵母菌多见于肺部真菌区系，占真菌种类的75%。
病毒组
病毒是最丰富和多样的实体，病毒组包括真核病毒（真核病毒组）和噬菌体（原核病毒组）。真核病毒感染人类宿主的细胞。它们可能是致病的，引起急性或慢性感染。它们也可以在病理状态（巨细胞病毒、单纯疱疹病毒）下重新激活，并且可以在没有任何病理的情况下持续存在。它们与免疫系统的相互作用似乎在呼吸系统疾病的发展中起着重要作用，尽管没有因果关系可以明确。第二类：噬菌体，感染细菌细胞。它们代表了在人类呼吸道中发现的大多数病毒。
整合病毒组的所有成分以获得对人类微生物组的全面了解似乎是必要的。
机械通气对呼吸道病毒组的影响尚不清楚。疱疹病毒科、副粘病毒科和小核糖核酸科的病毒在所有机械通气的ICU患者周中都已被明确。在重症监护病房患者中，由于病毒的重新激活，人类病毒组发生了较大的改变，特别是在疱疹组。感染EBV（14.6%）、HSV 1型（33-68.3%）和CMV（17%）的脓毒症患者呼吸道中的病毒再激活已被证实。这种病毒组生态失调可能与较长的ICU住院时间和死亡率有关。
在93例怀疑VAP的机械通气患者中，巨细胞病毒（CMV）肺部感染（定义为BAL中CMV复制）与机械通气持续时间延长、ICU住院时间延长和死亡率升高相关，而HSV在肺部复制与之却无关。此外，ICU中CMV再激活患者的细菌或真菌交叉感染率增加。病毒在VAP发生中的作用及其对患者预后的影响取决于病毒本身。这些数据大多来自目标PCR。
需要进行宏基因组研究来全面描述ICU机械通气期间肺病毒组的演变，并确定病毒生态失调在患者预后和VAP发展中的作用和机制。
临床应用
虽然采样和数据处理的效率正在提高，但微生物组分析在临床医疗决策中的应用还没有完全开展。目前实时测序技术的发展可以通过快速准确的生物种类鉴定影响诊断方法。 捕捉时间动态和确定微生物丰富性的生态失调特征和阈值是区分气道定植和VAP的关键。此外，早期发现VAP高风险患者的微生物生态失调对改善临床实践及患者预后有很大意义。 早期的靶向VAP抗生素治疗，以期在选定的病人中进行常规微生物分析，而不是经验性地使用广谱抗生素，将是对抗抗生素耐药性的一个进步。比靶向VAP抗生素治疗更有意义的是，早期发现与VAP高风险相关的微生物失调患者，可以制定更有针对性的预防策略（在线补充材料详细介绍此类研究方法）。 ICU领域宏基因组学纵向分析研究还必须关注微生物之间的相互作用，以确定与VAP发生风险增加相关的细菌、真菌和病毒生物标记物。同时关注宿主反应将有助于更好地确定患者的发病特征。 总的来说，更好地理解病理生理学知识可以帮助我们确定目标细菌群、真菌群和病毒组（包括原核和真核病毒），以制定针对性的干预措施。使用益生菌或益生元或对VAP高危患者使用预防性雾化抗生素可能是治疗微生物生态失调可的一种方法（具体见在线补充资料），除此之外，也可以通过其他方式取得临床获益，如抗病毒或噬菌体疗法。
所有这些数据都强调了对人类呼吸系统微生物群采取国际标准方法采样检测的必要性，不仅包括细菌菌群，还包括真菌微生物群和病毒组。对单一类型的微生物群的分析可能会导致对微生物群对健康影响的片面看法。在未来，必须首先考虑达成统一的分析方法，并进行纵向研究，以更好地了解VAP的发病机制。
高通量测序和生物信息分析方法的发展虽然复杂且昂贵，但会让我们更深入的探索全球人类呼吸系统微生物群，以便更好的预防和治疗医院获得性肺炎和ARDS等。
真菌、细菌和病毒（噬菌体和真核病毒）之间的相互作用强调了同时分析其演变的必要性，以了解VAP的病理生理机制及其在ARDS病程中的作用。 经验证和认可的分析方法（提取、扩增、测序、生物信息分析）应允许微生物组研究的均匀化和研究之间的对比。