综述 | Mass Spectrom. Rev.：液相色谱-串联质谱法对内源性生物标志代谢物绝对定量方法开发与验证的策略及挑战
编译：红烧大肥鸥，编辑：Tracy、江舜尧。
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代谢组学主要应用于药物开发和个性化医学的生物标志物鉴定，是一个动态发展的领域。大量的代谢组学研究已经确定了原则上可以转为临床实践的内源性代谢产物，但是很少有代谢组学来源的生物标志候选物质被监管机构批准用于临床。生物标志物鉴定过程中的此类阻碍很大程度上可归因于不适当的研究设计和不足以支持生物标志物临床应用的数据等等；另外，缺乏可靠的候选生物标志物定量分析方法被认为是生物标志物鉴定过程中的一个潜在瓶颈。事实上，内源性代谢物的性质阻碍了当前生物分析方法验证指南的应用，因此科研人员做出很大努力尝试修改现有指南和/或开发替代方法以便于方法验证。在这篇综述中，我们讨论了内源性代谢物方法开发和验证的三个主要挑战，即基质效应评价、替代性空白基质和内标（IS）的选择。一些研究修改了欧洲药品局用于评价基质效应的方程式，但也给出了替代方法，例如，可以在溶剂和生物样品中生成校准曲线，并且可以通过比率、相对标准偏差或在对内源性代谢物t检验进行定量中使用改进的Stufour方法。IS选择则不同，在以代谢组学为基础的研究文献中报道了七种可能的确定类型，每种类型都有其优点和局限性；但是同位素标记的IS和通过同位素衍生的IS表现出优异的性能。最后，在内源性目标物定量方法开发和验证过程中对替代基质进行表征和测试，并且对这些替代方案进行了详细讨论，突出了它们的优点和缺点。这篇综述的目的是比较，评价和辩论当前的知识和实践，以帮助研究人员和临床科学家开发候选代谢特征的生物标志物过程中所需的可靠分析方法。
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内容
1. 简介
基因，蛋白质和代谢产物等生物标志物在医疗保健系统如指导疾病诊断和预后以及治疗管理的决策中起关键作用。的确，临床前和临床阶段生物标志物发现的深入研究正在进行中，以实现个性化医学的目标。代谢组学可评估生物系统中所有内源性和外源性（即从饮食或环境中）代谢产物，并已迅速证明了其在生物标志物发现方面的潜力。代谢组学的最终目标是将来自不同生化途径的代谢物与正常、患病和应激的生物学状态联系起来。与基因组学，转录组学或蛋白质组学不同，由于代谢物理化性质（即疏水性/亲水性，酸度/碱性，稳定性和挥发性）的多样性，代谢组学研究面临着独特的挑战。
代谢组学在发现生物标志物的过程中应用了靶向和非靶向的方法；核磁共振(1H-NMR)或带有相应数据库的高分辨率质谱通常用于生物标志物开发的早期发现阶段，其目标是用于定性或半定量实验；随后，需要靶向分析来准确定性和验证处在疾病状态下潜在的生物标志代谢物。上述手段通常需要适合于定量的仪器来实现的，例如在多反应监测中(MRM)模式下的三重四极杆质谱仪。尽管是基于质谱的代谢组学方法，但都需要色谱分离克服基质的复杂性和同位素干扰。液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)是代谢组学中最重要的平台之一，靶向平台和非靶向平台在实验设计上有很大的不同。与靶向平台相比，代谢组学分析（非靶向分析）不包含有关样品成分的任何信息，且准确性、精密度和选择性较低；此外，非靶向分析由于技术困难不使用校准曲线达到线性，缺乏标准品或足够的内标。因此通过代谢物的全定量来验证非靶向的结果极其重要，以免对错误的生物标记物进行临床测试，例如，Sreekumar等人通过使用线性离子阱-傅立叶变换离子回旋共振质谱仪分析组织、尿液和血浆中超过1126种的代谢物，发现肌氨酸是前列腺癌转移的潜在生物标志物；然而，用LC‐MS/MS（2H3‐肌氨酸为内标）定量后发现肌氨酸在健康对照、前列腺癌转移患者和前列腺表面抗原增加患者之间没有显著差异。
探究生物标志物的实验可在任何组织或体液上进行，尤其血液和尿液得到广泛使用。血液反映了分解和合成代谢状态的最早时间点之一，而尿液则代表了在特定时期内整个身体的平均状况，因此它们的综合使用可能会产生互补的信息。
尽管含盐量高带来了挑战，但由于其代谢物浓度高且收集物具有非侵入性，尿液仍是有吸引力的生物体液。事实上，尿液代谢组的变化已经在癌症、呼吸道疾病、射线照射、抑郁症、金属毒性、Ⅱ型糖尿病和其他疾病中研究过。由于其广泛的应用性，与其他生物液体和组织提取物相比，在这篇综述中我们重点强调以尿液为基础的案例。与血液代谢组学不同，尿液代谢组学需要应用一个标准化因子来解释受试者间和受试者内的体积变化，虽然已提出各种标准化技术，肌酐和渗透压的标准化仍然是最常用的技术。最近，我们在32个代谢物的代谢组学数据集的统计模型中证明了两种归一化策略的可比性，这些数据集通过LC-MS/MS验证方法获得，并使用偏最小二乘法判别分析进行处理。
尽管我们通过代谢组学发现了大量的生物标志物，但很少是被美国食品和药物管理局(FDA)批准的临床生物标志物。生物标记物的鉴定旨在确认该标记物与疾病之间的一致性联系，同时也期待能说明对试验结果的生理、药理、毒理学或临床意义。一些障碍会阻碍生物标志物的鉴定，例如，偏倚、小样本量、小效应量和不恰当的研究设计会影响支持该生物标志物临床应用的数据质量；另一个潜在的障碍是缺乏成熟的分析方法来提供准确、精确和可靠的生物标志物定量数据。现有的生物分析方法验证的监管指南，如FDA和欧洲药品管理局(EMA)发布的指南主要是针对外源性物质，即活性药物成分及其代谢物；相比之下，生物标本中内源性代谢物的存在可能会阻止这些指南的直接应用，使验证过程不仅耗时且极具挑战性。事实上，内源性代谢物的绝对定量在很大程度上受到空白基质和缺乏标准品或内标的干扰，另外关于数据的预期使用可指导分析验证过程的水平已经达成共识。一种“适合目的”的方法，满足最低的性能特征，可以作为探索性研究的良好起点，并且与为临床应用设计的方法相比，其本身需要的验证较少。
国际人用药品技术要求统一委员会（ICH）已发布了生物分析方法验证的准则草案（目前正在咨询中）；尽管有一章节专门讨论了内源性代谢物绝对定量(ICH， 2019)，但仍缺乏对所提方法挑战和局限性的详细讨论。本篇综述讨论了一些可能阻碍内源性代谢物绝对定量的LC - MS/MS方法发展和验证的挑战；另外，实验设计参数可能与外源性生物分析显著不同，比如我们做了关于内标选择的通用方法的概述，详细描述在内源性代谢物存在下的基质效应(MEs) ，并将重点放在了由于空白基质导致方法开发和验证的挑战上。本文讨论了过去和最近用来克服这些困难的策略，读者也将会看到，并非这些方法都是通用的，研究人员的创新以及对问题的基本理解往往是解决方案。
2. 基质效应（MEs）
MEs在样品制备或色谱分析过程中通常来自未检测到的代谢物、盐或样品中引入的外源干扰物质洗脱产生的；此外，检测到的代谢物可以促进离子相互抑制，如核苷酸（图1）。研究者使用可切换色谱柱的LC/LC-MS技术以单离子监测模式对大鼠肾脏提取物中的11个核苷酸进行了定量。为了证实核苷酸对离子的抑制作用，我们通过柱后输注NADP+来评估MEs。在没有矩阵的情况下，得到一个恒定的NADP+信号。另一方面，当注入基质时，在洗脱核苷酸的保留时间观察到NADP+的负峰(图1)
图1 LC/LC-MS定量分析大鼠肾脏提取物中11个核苷酸（上）的TIC图
除了样品的复杂性和代谢物与周围基质的比例外，MEs也取决于所使用的电离源，特别是常用的电喷雾电离(ESI)和大气压化学电离源(APCI)，这两个离子源在现代质谱仪器中很容易切换，与ESI相比，APCI出现的MEs较少。有关APCI和ESI中带电离子形成机理及其与ME的关系的进一步讨论可在文献中找到。
造成MEs的一个主要因素是目标化合物的理化性质。研究者使用4种方法从血浆中提取3种药物（咖啡因，非那西汀和专有化合物）证明了ESI-MS分析中的MEs。流动注射的结果表明无论采用何种提取策略，咖啡因作为极性最强的物质最容易受离子抑制的影响，而非极性化合物受到的基质效应影响最低。作者认为，化合物的化学性质可能比样品制备方法本身对离子抑制程度影响更大，建议读者主要侧重于外源化合物分析，参考有关MS分析中ME的广泛评论和一般性讨论。
建议读者参考其他关于MS分析中MEs的广泛评论和一般性讨论，主要集中在外源性化合物分析。在接下来的章节中，我们将讨论MEs的评估方法和内源性代谢物定量过程中这种影响的最小化策略。
2.1 评价内源性代谢物的MEs
FDA要求对MEs进行评估，但是对于这类实验缺乏实用的指导方针；相反，2019年ICH发布的M10指南建议使用来自6个批次三份低质量控制(LQC)和高质量控制(HQC)样品用于外源性物质的MEs评估。测量的精度应在标称值的±15％以内，而以相对标准偏差（RSD%）形式表示的精度应小于15%。这些指南理论上可以外推内源性代谢物；然而，它们需要对6种基质源进行初步分析，以确定代谢物的内源性水平，因此需要大量的时间和资源来进行补充分析；此外，这些指南并没有揭示基质在每种代谢物和内标之间的作用是否一致。
相比之下，EMA建议使用六种不同批次空白基质，并对LQC和HQC样品进行MEs评估，代谢物或其IS的基质因子(MF)根据公式（1）计算：
MF代谢物或IS = 空白基质中的峰面积/纯溶剂中的峰面积；
而IS归一化后的MF表示为：MF代谢物/MFIS ；公式（2）。当MF分析物用百分比表示时，通常使用MEs (ME%)这个术语。EMA没有提供关于MF值的任何标准；然而在六个评估批次中，IS归一化后MF的RSD%不应超过15%。EMA和ICH指南都没有区分所研究的基质类型和具有代表性样品的批次数量。
表1 内标法测定血清中18种胆汁酸
CA，胆酸；CDCA，鹅去氧胆酸；DCA，脱氧胆酸；GCA，糖胆酸；GCDCA，糖去氧胆酸；LCA，石胆酸；UDCA，熊去氧胆酸。
EMA的建议虽然明确，但由于缺乏无分析物的基质因此不能直接适用于内源性代谢物的方法开发，因此本文还介绍了对上述方程的其他修正方法。据报道，最简单的方法仅针对IS生成MF值，例如Scherer等人开发了一种使用7个ISs（表1）检测血清中18种内源性胆汁酸的LC-MS/MS方法。ISs根据代谢物保留时间的接近程度对其进行分配；然而，在糖胆酸和它的内标，即d4‐甘鹅去氧胆酸之间观察到长达1分钟的保留时间差异（表1）。在血清中ISs的MF值被抑制了25%。这种方法的一个主要缺点是假定代谢物及其结构相关的IS有相似的ME，尽管它们有不同的保留时间。事实上，有报告表明即使在溶解状态下基质对IS和待测化合物的影响存在差异，这种差异会破坏定量数据。的确，如果仅根据Scherer等人的描述，仅根据来自IS的信号评估ME，就可以完全忽略电离行为的这种差异。
另一种方法是在数据处理之前通过公式（1）和（2）校正内源水平。在血清和脑脊液中色氨酸及其16种相关代谢产物的分析中这一方法被Henykova等人采用。不巧的是作者没有明确规定内源性水平校正的方法，我们猜测可能是通过从加标样品中减去内源性代谢物的峰面积。有趣的是，作者发现6个个体的代谢物信号受到了极端的基质抑制(ME% >15.6%)和增强(ME% <414.4%)的效果，且MF的RSD%值也很高，在色胺中高达52%。只有结合了17种同位素标记的IS后，这种效应才能得到纠正，并且IS标准化MF的RSD%值降低到15%以下。
与Henykova等人不同，其他研究详细介绍了对EMA方程所作的修改方法。例如，1‐甲基组氨酸和3‐甲基组氨酸的MEs评估是通过将6个尿液来源分为3组进行的，每组重复5次。(A)组为含有内源性代谢物的“空白尿液”样本；(B)组为加3×定量限(LLOQ)标准品的“空白尿液”；(C)为纯溶剂，加标量也为3×LLOQ。所有组均按原样加入等量的d3‐3‐甲基组氨酸。根据公式(3)：
ME%=[(峰面积B-峰面积A)/峰面积C] ×100
利用峰面积计算代谢产物的ME%；另外，IS归一化的ME是按照EMA指南计算(公式(2))，这种方法虽然很有前景，但在样品制备数量方面有一个严重的缺陷。
尽管只是在LQC水平评估，但总共需要60次注射(A组：6个来源，5次重复；B组：6个来源，5次重复)，以及在纯溶剂中运行的重复等效标准品(即总共90针)。在我们看来，通过减少重复次数，同时将不同基质批次的数量保持在最少的6个，可大大减少本实验的工作量。
相反，Lv等人(2015)为14种阿尔茨海默病中儿茶酚胺生物标志物的MEs评估开发了公式（4）：
ME%=[(加标空白基质的响应比-空白基质的响应比)/等效标准溶液响应比] ×100
不像式(3)在计算中不考虑IS的情况，式(4)中的响应率为：代谢物峰面积/IS峰面积，即将IS归一化，尽管简单，但就实验工作量而言这种技术与Henykova等人所述方法相比无任何优势。式(4)的意义是直接生成归一化的MF值，计算出RSD%从而进一步简化了当前的EMA指南。然而根据我们自身的经验，我们建议需要分别对代谢物和IS归一化后的MF进行评估，特别是在方法开发过程中。通过这些计算公式提供的信息可以批判性地评估所选ISs、样品处理程序和色谱分离的适用性。
来自EMA的公式并不是评估MEs的唯一方法，另一种方法是比较通过标准添加法在纯溶剂中的代谢物标准品与在生物基质添加代谢物标准品的校准曲线斜率，这种对比可以通过修改的Student-t检验或生成斜率比来实现。Stanislaus等人通过使用12C2 / 13C2-p-二甲基氨基苯甲酰溴试剂进行柱前衍生，对人尿液中的18种酰基古霉素（先天性代谢缺陷的潜在生物标志物）进行了定量。通过将衍生化标准品加入纯溶剂以及未衍生化和衍生化尿液中生成校准曲线进而评估MEs；此外，该方法允许评估未衍生尿液在替代衍生化基质中的适用性。使用公式（5）比较斜率：
修改的student t‐test = (b1 − b2)/Sb1 − b2
其中b为斜率，下标为比较的两条回归直线，Sb1−b2为回归系数差的标准误差，未衍生尿液和衍生尿液之间未观察到显着差异，因此，在制备验证样品时前者被认为是适合的替代衍生尿液。
另一种简单的方法是通过比较生物基质和纯溶剂产生的斜率。虽然t值可以用来接受或拒绝无效假设，但研究者可以根据自己的判断在评估MEs前设定一个可接受的比率值范围，例如，斜率比从0.9~1.1表示在测定尿液中的18种氨基酸时可以忽略基质干扰；而另一个研究小组报告的0.82~1.22范围表明可以忽略来自尿液、粪便和血清的基质干扰。
图2 5种不同批次血浆制备并用带有离子喷雾(ISP)和加热雾化器(HN)的高效液相色谱分析四环化合物的标准曲线斜率比较
虽然预先设定的比率值范围是可以接受的，但也有报道使用斜率比率的RSD%来评估MEs。该技术需要在纯溶剂和生物样本中制备多个校正标样 (至少三个)以产生有统计意义的平均值、标准偏差和RSD%值。该技术用于合成的代表性化合物及其结构相关的IS，并在纯溶剂（n = 5）和五批不同血浆中作了7个校正点：这项工作的主要目的是研究MEs与电离源的关系。采用加热雾化器作为离子界面，血浆斜率的变化相对较小（图2）且与纯溶剂计算值无显著差异(RSD%；3.5%血浆和1.3%溶剂)。而采用离子喷雾(ISP)时，MEs随着斜率的RSD%变化而变化，在溶剂和血浆中分别为0.9%和14.9%（图2）。作者将这一发现归因于与加热雾化器相比，ISP电离对MEs的敏感性更高。当使用单个血浆批次构建校准曲线时(即同一批次的相似MEs) RSD%值从14.9%降低到2.4%，进一步证实了这一结论。
总的来说，每种方法都有其优点和缺点，ICH指南并不评估代谢物和相应IS的个体性能。针对EMA公式的修正方案表明它是最接近监管准则的评估工具，并且可能是最简单的策略。尽管斜率比法很有潜力，但它是一种相对较新的方法，并没有被广泛应用。最后，由于需要在同一批生物体液的不同批次中准备多个校准集，因此使用斜率比的RSD%更加耗时和资源。建议研究人员在采用评估ME的方法之前考虑所有这些因素。然而我们推荐Henykova描述的方法，因为它在方法开发过程中提供了至关重要的基质效应的详细信息。在我们自己的工作中，我们采用了这种方法，因为它代表了与EMA指南中所述的公式最接近的变量。
2.2 MEs的最小化
一般来说，MEs在四个主要阶段中减少：(a)样品制备；(b)色谱分离；(c)质谱分析；(d)通过添加标准品的校准策略。表2总结了在样品分析的每个阶段可采纳的不同策略。尽管所有阶段都很重要，但选择合适的IS是控制ME的基础，因此，本章节将作为单独部分详细讨论。以下各节包含选定的研究，这些研究通过以上四种建议方法之一纠正了MEs，同时定量了主要内源性代谢物。
表2 内源性代谢物定量过程中潜在基质效应最小化策略的总结
在样品制备阶段降低MEs可通过样品稀释或萃取来实现，但是，由于稀释会导致灵敏度下降，这种方法仅适用于高浓度的代谢物。例如有研究对比了39种来自小麦和玉米粒中存在极性差异的霉菌毒素，并观察到玉米提取物中的ME强度比小麦中的更强（例如，黄曲霉毒素B1的信号被抑制75%，而玉米中为4%），10倍稀释后的提取物MEs总体降低，包括黄曲霉毒素B1(信号抑制66%)；然而，这种稀释降低了定量所需的灵敏度，因此最终采用了1:1稀释法。
样品萃取也可以减少MEs，然而，由于所研究的代谢物理化性质的多样性和/或它们与杂质间物理化学性质的相似性，这一方法受到了阻碍。实际上，这样的挑战会使选择性萃取法难以实现，例如Henykova只能使用甲醇沉淀蛋白从脑脊液和血清中提取17种色氨酸相关代谢产物，作者承认由于研究对象的理化多样性而缺乏萃取选择性，因此应选择适当的IS来解决基质干扰，在另一个例子中，作者在扇贝组织中使用LC-MS定量了四种作为腹泻性贝类中毒生物标志物的毒素。对扇贝肝胰脏进行液液萃取后，萃取液毒素的质谱响应比在纯溶液中低19% ~ 42%；特别是观察到样品间基质复杂性的巨大差异，改变萃取溶剂在该研究中不可行，且与色氨酸相关代谢物的定量不同的是这里没有合适的ISs，因此，采用了单点标准品添加技术，该技术要求在样品中添加已知和未知浓度的标准品。
校正ME的下个阶段是色谱系统，有研究采用LC/LC-MS/MS在定量尿液中4-硝基苯酚和3-甲基-4-硝基苯酚过程中评估MEs，其中第一根色谱柱（C18）的洗脱液直接流向第二根色谱柱（烷基酰胺）进一步分离，与传统的LC-MS/ MS平台相比，可以做到降低ME的效果（88%~104%）；后一种技术在外部校准模式下具有广泛的离子抑制作用（4-硝基苯酚≥29%，3-甲基-4-硝基苯酚≥3%），而使用d4-4-硝基苯酚作为3-甲基-4-硝基苯酚的IS则有离子增强作用（≤203%）。MEs的降低是由于不同分析物与第二个色谱柱固定相间的相互作用增强了方法的选择性，虽然这个例子讨论了外源化合物，但它突出了LC/LC在克服MEs方面的潜在用途，然而这样的改进可能会以牺牲分析时间为代价。色谱系统中另一种有价值的修改策略是减小固定相的粒径，它可以改善目标代谢物的分离度，同时降低MEs。有人在定量血清中的18种胆汁酸研究中采用了该技术，其中粒径从2.5~1.8 µm的变化可使MEs降低两倍。MS分析中将电离源从ESI改成APCI的是控制ME的另一种方式，它适用于外源和内源化合物。
3.靶向代谢组学中的ISs
IS不仅考虑了样品制备过程中的目标物损失情况，而且还包括分析平台引起的错误，这些错误最终会危害定量分析的可靠性，因此所使用的IS其理化性质应与目标物相同或相似。图3汇总了不同类型的ISs，可用于代谢组学分析。
图3 内源性代谢物的代谢组学工作流中涉及的IS
以雌二醇为代表性结构，IS可以是（A）代谢产物的同位素形式；（B）非同位素结构类似物;（C）同位素结构类似物; D，F和E内标分别通过A，B和C的衍生化产生；（G）感兴趣的代谢物的衍生产品。除（G）外的所有形式均用于雌二醇或相关雌激素的实际定量。IS，内部标准。
3.1 ISs的选择
3.1.1 稳定同位素内标（SI-IS）
SI‐IS是待测目标物的同位素形式，通常含有氘(2H)、13C或15N形式（图3）。SI‐ISs已广泛应用于代谢组的定量中以降低MEs，其中MEs可抑制代谢物高达85%的离子化。尽管使用广泛，但氘代IS可能由于亲脂性差异而无法与目标物共洗脱，这种现象被称为“氘代效应”，可能不利于定量分析，例如， S -卡维地洛及其d5-内标0.02分钟的差异导致在特定批次人体血浆中MEs的抑制不充分，相反在色谱分析中13C和12C原子表现出相同的理化性质，因此表现出相似的分离行为。氘代交换是另一个缺点，并且是氘代IS所独有的。在氘化IS中，结合到N或O原子上的氘可以在离子化过程中立即与氢发生交换。罕见的氘与碳原子的交换也有文献报道。提供各种同位素试剂的商业来源很少，由于无法得到所需的产品或高成本，同位素内标获取大多通过实验室合成。
表现出与目标代谢物类似的生化性质的结构类似物或化合物 (图3)可作为SI-IS的第二选择。例如，仅使用一种结构类似物作为IS，即1，6-二氨基己烷，就可以定量分析尿液和血浆中14种潜在的肝癌生物标志物，包括亚精胺和赖氨酸。所有代谢物在5分钟内洗脱完，这个时间是代谢物的集中保留时间段，虽然该方法的线性和精度在统计学上是可接受的，但准确性的数据没有呈现出来。同样有人开发了一种LC-MS/MS方法，将异胞嘧啶当作IS定量在18分钟时间内洗脱的13种潜在尿液生物标志物；该研究将大体积的（50 µL）核苷注入色谱系统，并在150 mm×2.1 mm 的C18色谱柱上以0.2 mL/min的流速进行分离。尽管注射量大且尿样制备简单，但作者没有报道MEs。此外，大多数核苷的线性范围超过1000倍，但用于校准的量化因子没有报道；也没有进行样品稳定性研究；最后作者仅计算RSD%值的范围(14.92%)以支持方法重现性，尽管结果勉强可接受。
根据我们自己的经验，结构类似物对于分析方法的优化/验证可能更具挑战性。在实验室中，我们使用LC-APCI-MS/MS方法使用了两种结构类似物来定量芥花籽油中的四种植物甾醇和四种生育酚，由于其信号的波动，两个IS中的一个IS一直未能通过两种生育酚的LQC和LLOQ。合理的LQC和LLOQ值只有在将定量方程从线性变为二次方后才能获得，通常，如果在方法开发期间选择结构类似物作为IS，我们强烈建议格外小心，如果可以使用其他同位素标记的IS，则最好不使用。
为了克服使用多个SI-IS的成本和实用性挑战，单个SI-IS就可以用于定量保留时间接近的代谢物，并且可以用作SI结构类似物（图3C），例如，Klepacki等人在肾功能不全患者尿液中定量了10种潜在的高极性和低分子量的生物标志物，根据其在HILIC色谱柱上的保留时间，将代谢物分为五类。将IS分配给以下各组：葡萄糖，草酸谷氨酸，山梨糖醇（d6-葡萄糖），TMAO（d9-TMAO），肌酸酐（d3-肌酸酐），乳酸，尿酸，马尿酸（d5-马尿酸）和柠檬酸盐和琥珀酸酯（d4-琥珀酸酯）。虽然某些代谢物是根据其SI-IS定量的，但其他代谢物（例如乳酸和尿酸）是针对结构上无关相似保留时间的IS定量的。尽管所有代谢物均在1分钟的时间内洗脱下来，但作者并未讨论选择IS的理由以及是否使用较少的IS是否损害方法的稳定性，但是，经过充分验证的HILIC-MS/MS证明了是准确性和精密度和低ME的方法。
同样，同位素标记的谷氨酰胺被用于定量前列腺癌患者尿液中六种重要的生物标志物代谢物，有趣的是，谷氨酰胺不是该研究的潜在候选化合物。作者没有指定谷氨酰胺的同位素形式（13 C或含d），也没有讨论选择该IS的理论依据，因此，尚不清楚在进行研究时是否有其他SI-IS上市，或者其他SI-IS施加的干扰影响了谷氨酰胺的选择。虽然该方法具有很高的精确度（RSD%<5%），但作者还是采用了比监管指南建议的标准85%-115%更高的准确性接受范围（80%-120%）。尽管采用了更广泛的范围，但肌酐的准确性在LQC仍然不合格（130%），此外，LLOQ没有包括在对所有6种代谢物的方法的准确性和精密度的验证中，也没有规定其在校准曲线中的接受标准，根据不同的监管指南，通常是20%。同位素标记的谷氨酰胺与所研究代谢物保留时间差异引起的错误可能是采用更高的接受限以提高准确性的潜在原因，但是作者没有提供任何理由。
IS的另一种形式称为ID‐IS。 ID-IS是通过分子内特定功能基团（例如氨基，羧基和酚基）的柱前衍生化产生的，通常，在LC-MS/MS分析复杂样品中衍生化在使用具有多种优势。衍生化改变了小分子代谢物的理化性质，从而大大改善了它们的色谱分离和质谱响应，最重要的是，它将分子转化为外源性的衍生物。
ID‐IS可以通过位于IS结构中的同位素原子(图3D~E)或衍生试剂(图3F)产生。当含有同位素的ISs可用时（即SI-ISs或SI-结构类似物），可以使用非同位素衍生试剂(图3D和E)。该技术可以分析口腔液中的微量代谢物从而应用在法医领域，但是其最普遍的应用是激素分析，与其他定量方法相比，它仅需要简单的样品制备步骤，例如，15个内源性雌激素代谢物与丹酰氯反应，5个SI- ISs与同一衍生试剂反应生成5个ID‐IS，并成功开发了一种经过验证的LC-MS/MS方法。高灵敏度允许仅需0.5 mL尿液便可定量绝经前后女性和男性的目标代谢物。也可以将非同位素结构类似物IS与非同位素衍生试剂结合，生成非同位素产物（图3F）；但是，该技术并未在基于MS的研究中采用。Xia等人报告了使用LC-MS / MS在丹磺酰化后乙醛后测定小鼠血浆和脑组织中雌酮的含量。
生成ID-IS的另一种方法是同位素标记衍生化试剂（图3G）。通过这种方法，每个代谢物都会产生一个IS，并出现一对色谱峰并因此提供了进一步的确认结构信息，这种技术是加拿大艾伯塔大学的李博士小组研发的。随着具有不同化学性质的同位素试剂的引入，它在代谢组学界进一步得到发展，例如，由12C2/13C2-二甲基氨基编码的丹磺酰氯可用于胺，酚和醇的定性和相对定量。12C2/13C2-对二甲基氨基苯甲酰溴已用在酸，而d7-溴代丙酮基喹啉也已用于硫醇。
尽管ID-IS具有潜力，但在绝对定量内源性代谢物上的应用正以缓慢的速度增长，可能的原因包括与非衍生化（直接）方法相比，在方法开发和验证过程中需要额外的衍生化工作量，以及在样品处理的额外步骤中警惕避免潜在代谢物丢失；相反，ID-IS的分析改善优势可能会取代相关的工作量。用LC-MS/MS法定量分析丹磺酰基-异亮氨酸，哮喘和慢性阻塞性肺疾病（COPD）的潜在生物标志物，在衍生化尿液的分析中出现了几个色谱峰，其中两个色谱峰在0.25分钟从丹磺酰基-异亮氨酸处洗脱（图4A），而定量和定性的MRM转换都无法区分异构体（图4B）。实际上，人类代谢组学数据库揭示了10种质量为131 Da的尿液代谢物，它们可以与丹磺酰氯反应，类似于异亮氨酸。这些代谢物中的六种是异亮氨酸的位置异构体，预计在色谱分析过程中会一起洗脱；然而，使用13C2-丹磺酰基-异亮氨酸IS，由于12C2/13C2-丹磺酰基-异亮氨酸的共洗脱，仅形成了一对色谱峰（图4C）
图4 存在干扰的共衍生化代谢物的哮喘患者尿液样品中丹磺酰异亮氨酸的鉴定
其中（A）的XIC为365.15> 170（定量转换）；（B）是365.15> 170和365.15> 350的XIC（量化和定性转换）；（C）的XIC为365.15> 170、365.15> 350（定量和定性转变）和367.15> 172（13C2-丹磺酰-异亮氨酸为内标）；（D）是丹磺酰异亮氨酸及其产物离子的结构。XIC，提取离子色谱图。
3.2 IS优化的挑战和实践
IS纯度的评估是必要的，因为存在相似合成路线非同位素分析物或试剂杂质，同位素形式化合物可能会含有痕量的非同位素分析物。尽管由IS引起的错误是不可避免的，但在FDA，EMA或ICH指南中并没有很好地定义其可接受的标准。对分析物的选择性评估表明，在空白基质中在分析物质谱通道处观测的干扰应小于LLOQ的20%。因此，评估IS纯度的最初做法是将IS加标到用于制备样品的不含目标物的基质中。应该整合在分析物通道上观察到的干扰，并将其与LLOQ进行比较，如果不适用更高纯度的IS，则可以通过降低其浓度来相应调整IS的浓度，使其干扰度小于20%。
第二种可能的干扰源与由于周围基质造成IS信号的不一致性有关。固相萃取（SPE）-LC-MS/MS法得到了开发并可用于定量血浆中的哌嗪喹啉， d6-哌喹用作SI-IS，其中萃取步骤包括添加19 µL三乙胺，并在70°C水浴中蒸发溶剂。结果发现，不完全蒸发产生的三乙胺残留物分别不同程度地抑制了哌喹和d6-哌喹的离子化，导致高达50%的定量误差。为了克服这个问题，研究者将样品干燥后在相同条件下再干燥一个小时。作者将这一发现归因于分析物与其IS之间的亲脂性略有差异，导致分析物共流出时仅微量的离子抑制三乙胺残留。同样，在胆固醇药物开发领域，Jemal等人报道了d7-甲羟戊酸（甲羟戊酸的SI-IS）随尿素批次的变化而发生不同程度的MEs，结论是在不同的测定中其他IS可能会发生类似的行为，因此在方法开发过程中应充分注意对目标物及其IS进行ME评估。
在对使用IS相关挑战的全面评估中，Tan等人讨论了12种不同的分析故障排除问题，其中IS强度在各种经过验证的生物分析方法中发生了意外变化。除了ME之外，他还提出了诸如程序，仪器或人为错误等原因。关于IS强度的变化是否会显着影响定量，很难给出一个清晰的共同结论。但是，强烈建议使用与分析物共洗脱的IS（即13C类似物）。
总而言之，尽管IS的信号不稳定可能不利于LC-MS/MS定量代谢组学，但使用SI-IS或ID-IS，尤其是含13C的化合物仍是目前分析过程中校正ME或其他变异的最有用策略。尽管如此，在常规样品分析过程中监控IS信号并识别任何危险信号仍然至关重要。
一般来说，FDA、EMA和ICH都没有在校正标准中规定IS相对于其分析物的推荐浓度。一种常见的做法是在其目标物的线性范围内增加SI - ISs或ID - ISs的浓度；然而，优化IS浓度仍然是基础，特别是当IS或代谢物诱导的离子抑制/增强效应可能导致定量错误时。例如，Liang等人证明在ESI和 APCI中，当加入ISs时，专卖药在纯溶剂中的信号被抑制高达88%，这会导致更高的LLOQ和灵敏度的损失，对于痕量代谢物的分析不利，因此应使用低浓度的IS。相反，Remane等人发现，抗抑郁药物浓度越高SI-ISs信号中观察到的离子抑制越多。在我们自己的工作中，我们注意到所选的丹磺化代谢物的校准曲线的性能随着13C2-ID-IS浓度的降低而降低(图5A和B)。仅存在两个质量单位差异，13C2丹酰化ID-IS位于其类似的12C2衍生代谢产物的同位素包膜中,因此随着13C2-ID-IS浓度的降低，具有m/ z值（+2质量单位）的衍生化代谢物的第二个13C2-同位素峰的影响与13C2-ID-IS通道相似，然后研究者使用13C2-ID-ISs浓度为定量上限的66.67%对该方法进行了优化（ULOQ；图5C）。
图5 使用三种浓度不同的13C2-丹磺化色氨酸内标物构建的13C2-丹磺化色氨酸的校准曲线
其中水平（A）为ULOQ的1.3％；（B）为ULOQ的16.67％; （C）为ULOQ的66.67％。校准标准物的准确度％随内标物浓度的降低显示出不可接受的值（突出显示）（右图）。ULOQ，定量上限。
图6 使用二元泵梯度系统在C18色谱柱（10 cm×2.1 mm ID，5 µm）上的17种丹磺化代谢物与其d6-丹磺化内标之间的保留时间差（以秒为单位）
在后台针对色谱运行时间展示了梯度程序的变化。代谢物按照其洗脱顺序排列，近似保留时间值。1MH，1-甲基组胺; ALA，丙氨酸；ARG，精氨酸；ASP，天冬酰胺；ETNH2，乙醇胺；谷氨酰胺; 甘氨酸，甘氨酸；HIS，组氨酸；ISO，异亮氨酸；赖氨酸赖氨酸; SAR，肌氨酸；SER，丝氨酸；TAU，牛磺酸; 苏氨酸; TRP，色氨酸；TYR，酪氨酸；VAL，缬氨酸。
实际上，建议同位素IS与它的类似代谢物相差至少3个质量单位，以避免在MS分析过程中发生串扰或同位素重叠。但是，由于ID-IS合成所需的SI-IS和同位素试剂适用性有限，因此这种质量差异可能不可行；此外，掺入大量氘代同位素IS可能导致氘代效应。我们尝试使用氘来增加丹酰化ID-IS的质量差异但并未成功，我们在实验室中合成了d6-丹磺酰氯，并将其与13C2-丹磺酰氯进行了比较。不幸的是在12C2衍生的代谢物和氘代对应化合物之间观察到了明显的氘代作用，因此使d6-丹磺酰氯不适合定量（图6）。
最后，与常规做法不同的是，如有必要可以将SI‐ISs加标到其代谢物线性范围以外的浓度。我们开发并验证了用于定量分析尿液中7种极性代谢产物（包括葡萄糖）的HILIC-MS/MS方法。在负离子模式下以m/z 225.1> 179.1进行监测的葡萄糖甲酸离子加合物至少达到10倍，比葡萄糖任何离子对通道都强。d2-葡萄糖IS有类似的电离行为（图7A）。但在相同的MRM通道中，未知尿素的内源性干扰严重影响了尿液样品中类似通道切换的使用（即m/z 227.1>181.1）（图7B）。不幸的是，d2-葡萄糖m / z 227.1> 121.1的信号强度显着降低，选择该信号是为了避免干扰。由于信号强度较低，因此将d2-葡萄糖IS的浓度加到葡萄糖ULOQ的两倍，以产生可定量的m/z227.1> 121.1信号（图7C）。总之，上述实例证明了在开发内源性代谢物的方法中优化IS浓度的重要性。分析人员可以将IS浓度优化为ULOQ的一半，低于ULOQ的一半，甚至高于ULOQ。
图7 在m/z 227>181.1扫描下（A）80%乙腈中的d2-葡萄糖内标物的提离子色谱图；（B）在m/z 227>181.1处观察到尿液样品的干扰；(C)成功消除了先前在m/z 227 > 181.1观测到的干扰
4. 用于方法验证的空白基质
根据FDA，EMA和ICH，验证应证明分析方法在定量特定生物基质中特定化合物的可靠性。校准标准品和QC样品的理想制备方法是将参考标准品加到与研究样品相同的无分析物基质中，但是当对内源性代谢物进行定量时，应探索其他方法来克服空白基质的稀缺性。在以下各节中，通过选定的示例介绍了可用于LC-MS/MS方法开发和目标代谢组学验证的基质类型。图8是一个提示性流程图，可以帮助分析人员为其目标内源性代谢物选择适当的替代基质。
图8 内源性代谢物生物分析方法验证中选择适当空白基质的建议工作流程
替代基质是生物基质的合成替代物。真实的基质是真实的生物样品，其中内源性代谢物的水平已得到校正。蓝色色框代表起点；绿色框表示矩阵的两种主要类型（代理与真实）。黄色框代表使用替代矩阵和真实矩阵的可能方法。
4.1 替代性基质
替代基质的最简单方法是使用纯溶剂制备校正标准品和QC样品（图8），例如，使用具有极性切换功能的超高效液相色谱（UPLC）-MS/MS方法和两个非同位素结构类似物IS定量大鼠血清，尿液和粪便中的11种微生物群宿主内源性代谢物。作者使用斜率比法（即生物样品中校准曲线的斜率/乙腈：水（基质验证）中校准曲线的斜率）来确定是否存在有问题的ME。该基质不含任何干扰盐或代谢物，它至少符合FDA，EMA和ICH建议的空白基质选择规范。我们认为，只有在探索和排除其他替代方法之后，才应使用这种类型的基质。
最丰富的内源性代谢物混合物(不包括目标代谢物)和特定生物基质的盐可以组合成人工培养基(图8)，尤其是在生物样本数量不足的情况下，这是一个很有吸引力的选择。不同配方的人工尿液、精液、阴道分泌液、唾液、脑髓液和眼泪可在文献中找到，也可以买到商业来源的人工基质。但是，根据我们了解，成分的完整列表通常是专有的，并不总是由供应商披露，这可能是有问题的，因为感兴趣的代谢物可能包含在商业配方中，例如，磷酸盐缓冲液（PBS）中的2%牛血清白蛋白（BSA）是一种血清替代品，但其显示出相当高的内源性同型半胱氨酸水平是血管疾病的潜在生物标记，这使血清定量的方法复杂化。在这项工作中，作者不是通过减法来校正内源性水平，而是使用其校准标准品中高半胱氨酸的总含量作为标称浓度（即内源和外源加标浓度的加和量）。QC样品在两种不同的基质中制备，即合并的血清（三个水平）和PBS中2%的BSA（四个水平），确保了分析方法的完全验证，虽然两种基质的QC样品制备是非常规的，但该方法得到充分的方法验证。
由于初始基质中通常存在其他的内源性干扰，人工基质在方法开发时可能存在困难，例如我们使用HILIC‐MS/MS在丙酮酸(一种潜在的哮喘生物标志物)的定量过程中人工尿液的使用进行了调查。在患者尿液样本中观察到丙酮酸基线升高，信噪比比人工基质低。在人工基质中开发方法不能反映生物液体中潜在的干扰，因此这种方法是不正确的。同样，在对淀粉样蛋白β肽（阿尔茨海默氏病的潜在生物标志物）进行定量分析时，人工脑脊液缺乏模仿人类脑脊液所需的淀粉样蛋白结合蛋白，大鼠脑脊液被用来代替方法开发和验证。人工基质也可能造成污染；例如PBS增强了核苷酸生物标志物的离子抑制作用，其使用需要经常清洗离子源。因此，Klawitter开发了在等渗盐水中加入6%BSA中的方法，用于定量大鼠组织中的11个核苷酸。
总体而言，由于公开发表的工作大多偏向积极成果，因此人工基质所面临的挑战很可能没有记录在案。Ocque在UPLC-MS/MS方法验证中使用PBS（pH 7.4）定量分析人血浆和尿液中的三甲胺N-氧化物、胆碱和甜菜碱（与动脉粥样硬化相关的代谢物），并在PBS中制备校正标准品和三级QC样品。另一方面，参与者的血浆和尿液样本使用甲醇SI-IS提取，提取物进一步用乙腈/甲醇（75:25）稀释。对于采用不同的生物标本制备程序时在PBS中充分验证该方法的原因，没有给出理由。根据ICH的最新建议，如果使用替代基质，则应仅将其保留给校正标准品而是QC样品，但是，分析人员应考虑在替代基质中改善的信噪比而非实际生物基质中，因为这可能会导致LLOQ的计算不准确。
4.2 真实的基质
除了合成药物外，验证样品时还可以加入真实的生物基质，从而反映研究样品的成分(图8)。研究者可以将生物基质掺入QC样品中，并将添加基质含量用作预期浓度。FDA和ICH关于内源性化合物的最新指南实际上已经推荐了这种方法。Joyce在定量18种氨基酸过程中，将代谢物标准品掺入646个样品中收集的尿液中从而制备了QC样品；另一方面，校正标准品是在纯溶剂中制备的。尽管证实了可接受的验证数据，但该研究有一个缺点是蛋白质用乙腈沉淀后添加了IS，因此提取期间的损失不予考虑。根据我们的经验，这种方法可能会对常规应用验证的方法构成挑战，其中，用于QC制备的合并样品中内源性代谢物可能会随着时间而降解，因此，我们建议定期评估合并基质中代谢物的效果。绕过这种障碍的一种可能的替代方法是内源水平的校正。
可以将真实的生物基质掺入校正标准品和QC样品中（图8）。内源性代谢物干扰可通过三种方法来纠正：（a）减去内源性水平的峰面积，（b）稀释生物基质，或（c）内源性代谢物的消耗（图8）。第一种方法的一个例子是Li等人在对六种氨基酸和酮酸定量的过程中，将合并的血浆样本掺入适当的标准品以进行校准和QC样品制备。亮氨酸（13C-类似物）和水杨酸（结构类似物IS）的SI‐IS用于定量六种代谢物，同时在3.5分钟后将正离子切换负离子模式采集，在生成校正曲线之前，从总峰面积中减去合并样品中内源水平的峰面积（加标前）。该方法在回归，准确度、精密度和稳定性方面验证了数据质量，这种方法的一个缺点是与使用替代基质相比灵敏度相对较低。LLOQ受目标内源代谢物天然存在水平的限制，因为在方法选择性评估期间，这些水平被视为空白基质中的“噪音”。为了获得更高的灵敏度，可以使用低浓度的研究样品来制备合并的基质，但是这种方法涉及对研究样品的初步筛选，可能很耗时。
第二种选择是在准备验证样品之前稀释合并的基质（图8），例如在定量肾脏功能障碍潜在生物标志物的过程中，在用代谢物标准品在尿液中加标前，先按1:5000的比例稀释尿液，以制备验证样品；患者尿液样品以1:40的稀释度进行了优化。当在多种内源性水平的背景下对多种代谢物进行定量分析时，这种方法将面临关键挑战，这造成单稀释因子的不适用。此外，样品稀释可能会大大改变研究样品与验证样品之间的MEs。
第三种选择是验证之前使用化学、机械或免疫学预处理手段从基质中去除内源性的代谢物水平（图8），例如，在验证LC-APCI-MS/MS定量方法的过程中，将合并的血浆样品在37°C下孵育2小时以去除内源性胸腺嘧啶核苷。用活性炭可以去除真实生物样品中的几种代谢物，并且已经应用于许多研究中（图8）。这种方法的相关缺点是即使在声称不含目标物的商业来源基质中也无法完全去除内源性代谢物（图9），另一个挑战是基质的原始组成成分发生变化。最后我们认为尽管真实的基质提供了与生物基质最接近的模拟，但应通过方法选择性和LLOQ的验证来研究其适用性。分析人员应评估此类基质带来的好处以及由于内源性代谢物在空白基质中被视为噪音而导致的更高LLOQ的缺点。
图9 XICs显示血浆在活性炭下其孕酮的不完全去除
其中（A）缓冲液；（B）剥离后的血浆；（C）溶出的血浆加标至20 pg/ mL；（D）低内源性浓度（66 pg/mL）的真实血浆
可以通过标准添加技术将真实的生物基质用于方法开发，而无需进行内源性水平校正（图8）。标准添加法克服了不同样品间的成分差异，因此提供了适当的MEs校正。实际上，根据ICH的最新建议，应该为通过标准添加方法定量的每个研究样品构建单独的校准曲线，因此，与常规策略相比，更大的样本量和更长的分析时间使该方法不适用于代谢组学。此外不能直接进行由不同监管机构描述的全面验证。如果进行单点定量，还需要事先建立线性范围。
在这种方法中，需要关注三个不同的对象，即目标代谢物、IS和替代性目标分析物。在方法开发和验证过程中，广泛使用替代性目标分析物对IS的响应率，同时计算代谢物对其IS的响应率以获取临床数据。替代性目标分析物是代谢物的同位素形式，在存在内源性非同位素化合物的情况下，以浓度递增的方式加标到用于校准标准品的真实基质中。IS是代谢物的第二种不同的理想同位素形式，但是，在定量小鼠中潜在的β-氧化生物标记物（乙酰基和棕榈酰肉碱）过程中，还使用了其他形式的IS，例如d3-辛醇肉碱（同位素结构类似物），然后使用替代性目标分析物和IS的峰面积比对替代性目标分析物浓度构建校正曲线。通过加入响应因子(RF)来修正回归方程（6），此因子旨在解决替代性目标分析物及其代谢物之间电离效率的差异，或纠正任何同位素效应的存在。
浓度代谢物 = [(峰面积代谢物/峰面积IS)*RF − b]/a
等式中RF =替代物分析物/代谢物，当量浓度时，a是斜率，b是回归线的截距。
尽管替代性目标分析物技术很有用，但缺乏合适的定量软件。校准物和研究样品需要分别处理，因为每个样品组都将代谢物的不同同位素形式识别为目标分析物。Kindt在大鼠脑组织中肌肌醇的LC-MS/MS定量分析（神经系统疾病的潜在生物标记）期间证明了另一个挑战：替代性目标分析物d6-肌肌醇无法提供足够的准确度和精密度数据，作者将其归因于不同同位素形式之间信噪比的差异。总而言之，我们强调使用不包含IS的替代性目标分析物技术（即外标法）可能无法提供已开发所期望的测定准确性。
4.2.5 真实的基质和ID‐IS
如上所述，柱前衍生化将代谢物转化为样品中不存在的新化合物，这样未衍生的真实生物基质可用于制备验证样品，真实的生物基质也可以暴露在与患者样品相似的所有衍生化步骤中并同时用溶剂代替衍生试剂。以这种方式，可以产生基质以紧密模拟真实生物样品所暴露于的实验条件（即热，盐和缓冲液）。
总之，在内源性代谢物中空白基质和IS的优化是开发可靠的LC-MS/MS方法所不可或缺的。在缺乏指导的情况下，分析人员可能会进行其他实验以确保进行充分的方法验证，例如，开发了一种LC-MS/MS方法来定量CSF中的甘氨酸（一种潜在的精神疾病生物标志物），ID-IS是使用丹磺酰氯和13C215N-甘氨酸生成的。尽管最好方式是使用真实基质，但作者还是在人工CSF中进行了验证。为了进一步验证他们的方法，作者展示了他们的方法与标准添加技术以及使用13C2-甘氨酸的替代性目标分析物方法类似的结果。
5. LC - MS/MS方法验证
用于内源代谢物定量的生物分析方法开发旨在优化实验设计和操作条件，例如选择合适的空白基质和IS。在优化过程之后，需要进行方法验证以评估该方法在分析研究样本中的适用性或稳定性。验证参数例如选择性、线性、准确度和精密度以及它们的接受标准，在各种法规指南中都有详细说明，因此本文不讨论它们。但是与外源性物质方法验证的主要区别是缺少不含目标物的基质，通常，使用真实的基质应伴有适当的纠正措施以说明代谢物的内源性水平（如第IV节中所述），而替代性基质则规避了这个问题。但是当校准曲线构建时，它们可能会导致错误的信噪比提高；此外，应彻底进行稳定性研究，尤其是代谢物在不同基质中以及在不同的储存温度、储存时间和冻融循环下的个体化行为。
在对生物分析方法进行全面验证之后，应该对研究样本进行分析以对候选生物标志物进行绝对定量。此外，应在数据收集的整个生命周期中定期对方法进行重新验证，以确保所采集临床数据的质量。理想情况下，用于内源代谢物定量的生物分析方法应与参考方法进行交叉验证。如果要将来自不同研究的不同完全验证方法的数据进行合并以支持有关生物标志物功效的监管决策，则这一点尤其重要。然而，我们认为，考虑到定量同一生物基质内特定代谢物完全有效的方法数量有限，因此并非总是可以交叉验证。最后，一般和特定标准操作程序的文档不能过分强调，有关方法验证、重新验证、修改和操作的每个单元的所有相关信息应确保分析人员之间结果的可重复性，而此信息最终将构成提交给监管机构的文件的一部分。
6. 结束语
代谢组学研究的目的是鉴定在应激生物状态下变化的内源性和外源性代谢物，候选生物标志物代谢物的临床应用资格要求具有可靠的高特异性验证试验。在此，我们讨论内源性代谢物定量分析的三个主要挑战，与外源性物质不同，这仍是研究领域中不断增长的挑战。虽然已达成共识，即始终应首先寻找含13 C的同位素IS，但在内源性代谢物的背景下，关于ME评估和空白基质选择的相似共识尚未建立。每种技术都有其优点和缺点，因此建议采用反复试验的方法，并根据分析性能做出最终决定。最后，最新版的FDA指南包括生物标志物和内源性化合物的单独章节反映了它们在改善疾病诊断和个性化医学方面的潜力。同样，在2019年2月起草的最新ICH指南中，几乎没有定量内源性代谢物的方法。
总之，本文对LC-MS/MS方法开发和验证挑战进行了广泛讨论，并对应对这些挑战的当前可用方法进行了全面回顾。本文中的综合知识将帮助研究人员和临床医生验证已鉴定的内源性生物标志物，并将知识从发现阶段转化为临床实践阶段。