新型冠状病毒核酸检测质控品使用手册
作者：袁玉华
单位：天津医科大学总医院空港医院检验科
新型冠状病毒（COVID-19）核酸检测作为新冠病毒感染实验室检测的金标准，实验过程的质量控制尤为重要，新冠病毒核酸检测必须使用质控品和标准品，才能保证结果的可靠。
2020年11月5日国务院应对新冠肺炎疫情联防联控机制医疗救治组《关于加强外送样本新冠病毒核酸检测质量管理工作的通知》中进一步明确：“每批次检测时，应当随机放入至少1份弱阳性（1.5-3倍检测限）和3份阴性室内质控样本，进行质量控制，以及时发现问题，避免假阴性和假阳性”，进一步强化了新冠核酸检测实验室质量控制的要求。
新冠病毒的高致病性及不稳定性，限制了患者阳性样本作为天然质控品及标准品的应用，因此，一个稳定可靠、且无生物传染性的 RNA 质控品和标准品，对于保证新冠病毒的 RT-PCR检测质量具有重要意义。
在核酸检测过程中，为保持与实际检测样品间扩增效率的一致性，作为标准品应尽量选择与实际检测样品结构近似的样品。
鉴于目前COVID-19核酸检测的国际标准或参考物质尚未建立，WHO颁布的“Emergency Use listing（EUL）: Instructions for Submission Requirements: In vitro diagnostics (IVDs) Detecting SARS-CoV-2 Nucleic Acid”推荐可以使用体外转录RNA 或假病毒作为新冠病毒核酸检测标准品及质控品。
假病毒是一类嵌合型病毒颗粒，通过基因工程手段构建出含有目的核酸片段及包装蛋白形成的复合体。1998年Pasloske[1,2]等开始提出了装甲RNA（armored RNA）技术，即由MS2噬菌体外壳蛋白包裹重组RNA的技术，这种假病毒无感染性，无自主复制能力，生物安全性高，核酸稳定，不易降解。另外一种是慢病毒载体系统构建假病毒，将目标基因克隆入慢病毒载体，与包装质粒一起转染 HEK293T细胞，包装出假病毒，该技术制备的假病毒具有假病颗粒稳定、安全，且可有效监控RNA样品核酸制备及RT‐PCR反应中逆转录过程[3,4]。
由于新冠病毒是RNA包膜病毒，慢病毒载体包装病毒无论在病毒直径和病毒包膜的结构上，都相对噬菌体更接近冠状病毒的结构，可以更真实地模拟临床样本，为多数质控品生产厂商采用的新冠假病毒制备方法。
人工合成的假病毒耐核酸酶作用，稳定性好，易保存和运输，能够参与从样品处理到扩增的全程质量监测，即可作为室内质控品监测实验精密度，也可定值后作为室间质控品[5]。体外人工合成的新冠病毒基因组RNA（裸RNA）可作为新冠病毒标准品对相应扩增试剂进行性能验证。
目前，假病毒质控品已大规模应用于新冠病毒核酸检测实验室，但在选择假病毒质控品的时候仍需注意几个问题：
1、实验室需明确所使用的假病毒质控品包含RT-PCR扩增试剂检测的靶基因，因不同检测方法学及试剂盒针对的基因及靶序列各异，推荐使用包含新冠病毒全基因组的质控品，确保所使用的质控品适用实验室所采纳的检测技术及试剂盒（截至6月12日，国家食品药品监督管理局已批准42个新型冠状病毒检测试剂盒上市）。
2、关注假病毒质控品的稳定性，在试剂盒说明书建议的稳定期内使用，导致假病毒质控品不稳定的原因比较多，可能是假病毒包裹工艺不完善，也可能是生产质控品流程的其他环节，建议在质控品使用前做稳定性验证。
3、假病毒质控品DNA残留问题，是假病毒生产过程中作为RNA转录的质粒模板产生，制造商须优化工艺，将质粒DNA残留减少至不影响RNA的检测，因病毒RNA的检测需经过RNA逆转录成cDNA后再进行PCR扩增，如果样本中有质粒DNA残留，也能直接通过PCR扩增出来，另外DNA的稳定性远高于RNA，因此不能反映实验室质控过程的真实情况，建议在质控品使用前做质粒DNA残留验证。
4、目前市场上的假病毒类质控品多为非定值质控品，如果用于对核酸提取效率进行验证，需使用定值质控品（可用数字PCR方法定值）[6]，扩增试剂的验证必须使用RNA标准品。
【参考文献】
1.Pasloske B L，Walkerpeach C R，Obermoeller R D，Winkler M，DuBois D B. Armored RNA technology forproduction of ribonuclease ⁃ resistant viral RNA controls and standards［J］. J Clin Microbiol，1998，36（12）：3590 ⁃3594.
2.WalkerPeach C R，Winkler M，DuBois D B，Pasloske B L. Ribonuclease ⁃ resistant RNA controls （Armored RNA） for reverse transcription ⁃ PCR，branched DNA， and genotyping assays for hepatitis C virus［J］. Clin Chem，1999，45（12）：2079⁃2085.
3.邓俊花， 吴绍强，假病毒在RNA 核酸检测中的质控品应用研究进展，兽医食品卫生与检验检疫专题 T 04 0 05 9
4.Mattiuzzo G，Ashall J，Doris K S，MacLellan ⁃ Gibson K，Nicolson C，Wilkinson D E，Harvey R，Almond N，Anderson R， Efstathiou S， Minor P D， Page M. Development of lentivirus ⁃ based reference materials for Ebola virus nucleic acid amplification technology ⁃ based assays［J/OL］. PLoS One，2015，10（11）：e0142751.
5.欧阳艳艳 张永卓 高颖 隋志伟 戴新华，新冠假病毒核糖核酸标准物质的研制和应用，中国计量，DOI:10.16569/j.cnki.cn11-3720/t.2020.11.033
6.D o n g L , Z h o u J , Ni u C, e t a l . H i g h l y accurate and sensitive diagnostic detection of SARSCoV- 2 by digital PCR. medRxiv 2020. https://doi.org/10.1101/2020.03.14.20036129