小麦叶锈病是由叶锈菌Puccinia triticina (Pt)引起的真菌性病害，严重威胁小麦的生产安全。我国曾发生过多次小麦叶锈病大流行，造成严重的产量损失。利用抗叶锈病基因培育抗病品种是防治小麦叶锈病最经济环保的措施。目前，已经正式命名了80个来源于小麦及其亲缘物种的抗叶锈病基因，但仅有7个(Lr1、Lr10、Lr14a、Lr21、Lr22a、Lr34/Yr18/Sr57/Pm38和Lr67/Yr46/Sr55/Pm46)基因被克隆。
周麦22(国审麦2007007)是河南省周口市农业科学院育成的高产、高抗叶锈病、条锈病和白粉病广适小麦品种，不仅是黄淮麦区主要推广品种，而且已成为重要骨干亲本，利用其育成的小麦新品种已经有100多个(高艳等 2021)。
河北农业大学李在峰和刘大群教授团队的王翠芬同学在攻读硕士学位期间(2010-2013)对周麦22的叶锈病抗性进行了遗传研究。利用周麦22与中国春构建的F2群体分别在苗期和成株期进行抗叶锈病鉴定，均发现呈现抗病:感病=3:1的分离比率。243个F2:3家系的多个叶锈病菌系鉴定结果呈现纯合抗病:分离:纯合感病=53:129:61的分离模式，表明周麦22中携带一个主效的苗期和成株期抗叶锈病基因，命名为LrZH22(Wang et al. 2016)。通过利用抗病性分离群体构建抗病和感病混合池，从1300对SSR引物中筛选出6个多态性SSR标记(Xbarc183、Xbarc55、Xgwm148、Xgwm410、Xgwm374和Xwmc474)和2个多态性EST标记(BF202681和BE499478)，将LrZH22定位于2BS染色体Bin 2BS1-0.53-0.75区段，介于标记Xbarc55和Xgwm374之间，与两个标记的遗传距离分别是2.4 cM和4.8 cM (图1)。
图1 周麦22抗叶锈病基因LrZH22的分子标记定位(Wang et al. 2016)
李淼淼博士在中国农业大学攻读博士学位期间(2014-2018)，从杂交组合ZK331/项麦99171//洛麦30*2的F3家系中鉴定到一个叶片早衰和正常叶片分离F3家系，正常植株(37株)和早衰叶片(9株)分离比符合3:1；F3:4家系纯合正常叶片(15):分离(22):纯合早衰叶片(8)分离比符合1:2:1。选取F3家系中纯合早衰系M114(图2)和纯合正常系W301配制杂交组合，F1为正常叶片，表明叶片早衰为隐性遗传，其F2代正常植株(323)和早衰植株(127)分离比符合3:1，F2:3家系纯合正常:分离:纯合早衰分离比符合1:2:1。遗传分析结果表明早衰性状受隐性单基因控制，暂命名为early leaf senescene 1 (els1, Li et al. 2018)。
采用BSR-Seq策略对els1定位，发现正常叶片与早衰叶片混合池间SNP差异富集于2BS染色体区段(图3a)。共开发了4个与els1连锁的多态性SNP标记WGGB302、WGGB303、WGGB304和WGGB305以及2个SSR标记WGGB306和WGGB307(图3b，3c)，将els1定位于小麦2BS染色体上WGGB305和WGGB303间1.5 cM遗传区间(图3d)，对应中国春9.2 Mb物理区段，含有69个预测的基因，包括NB-ARC、细胞色素P450、受体激酶、WRKY转录因子等可能与早衰或细胞死亡相关的基因，其中一个具有NB-ARC结构域基因上开发的标记WGGB302与els1共分离(Li et al. 2018)。
图3 小麦叶片早衰基因els1的定位(Li et al. 2018)为了精细定位和克隆LrZH22基因，李在峰教授课题组配制了周麦22X郑州5389精细定位群体，并先后派博士研究生张培培和闫晓翠到中国科学院遗传与发育生物学研究所刘志勇研究员课题组进行客座研究，期间发现LrZH22与els1定位于相同的基因组区段。
图4 周麦22(ZM)、郑州5289(ZZ)、M114和W301的叶锈病抗性表现(Yan et al. 2021)首先利用LrZH22侧翼的分子标记Xbarc55和Xgwm374筛选了周麦22X郑州5389杂交组合的7213个F2单株精细定位群体，共获得332个重要交换单株。利用BSR-Seq分析结果和中国春参考基因组序列，开发了与LrZH22紧密连锁的6个新的SSR和4个SNP标记，将LrZH22锁定于分子标记HBAU3和HBAU46间0.15 cM遗传区间，对应中国春2BS染色体68.95 kb基因组区段，其中HBAU5、HBAU12和HBAU458三个标记与LrZH22共分离(图5)，含有两个预测的基因TraesCS2B02G182800和TraesCS2B02G182900，分别编码具有NBS-LRR结构域的NLR蛋白和核糖核酸酶(RP)。序列比较发现，周麦22和郑州5389在TraesCS2B02G182800(NLR)等位基因间存在多处序列变异(包括SNP和InDel)，但在TraesCS2B02G182900等位基因间未检测到序列变异。基因表达分析发现，NLR基因在周麦22和郑州5389中均响应叶锈菌侵染表达，因此，推测周麦22中的这个NLR基因NLRZM是LrZH22的候选基因。
图5 小麦抗叶锈病基因LrZH22和早衰基因els1的图位克隆(Yan et al. 2021)
进一步研究发现周麦22中的NLRZM基因具有3种可变剪切：IF1、IF2和IF3(图6)。其中IF1是主要的转录本，约占90%，包含4个外显子和3个内含子，而且第一个内含子长约15.097 kb。IF1和IF2均编码1072个氨基酸的NLR蛋白，具有典型的Rx-CC-like、NBS和LRR结构域(图7)，但第3种转录本IF3编码一个564氨基酸的截断蛋白。
图6 抗叶锈病基因LrZH22的剪切体(Yan et al. 2021)
与此同时，还利用EMS诱变周麦22，从中筛选出8个感叶锈病突变体(EM1-EM8；图6)，进行MutRenSeq分析。经过与野生型周麦22序列比对，从5个突变体中筛选出6个存在序列变异的contig，其中一个Contig_13835与NLR基因序列同源。对周麦22和8个突变体中的NLR基因进行全长基因组DNA和cDNA测序，与周麦22相比，其中6个突变体(EM1-EM6)在NLR基因CDS序列上存在1-2个非同义碱基突变，导致发生错义和无义突变(图7)。另外两个突变体(EM7和EM8)未在NLR基因上检测到序列变异。感叶锈病突变体在NLRZM基因上的突变提示这个NLR很可能就是LrZH22。
图7 抗叶锈病基因LrZH22的突变体功能验证(Yan et al. 2021)
为了验证NLRZM的抗叶锈病功能，构建了玉米Ubiquitin基因启动子驱动的超量表达转基因载体pUbi:NLRZM(图8)，委托山东农业科学院作物科学研究所李根英研究员课题组利用农杆菌介导的方法遗传转化高感叶锈菌FHDS小麦品种Fielder。在12个再生的转基因T0代单株中，有7株为转基因阳性。携带NLRZM转基因阳性T0单株和T1家系阳性单株均高抗叶锈菌小种FHDS(图8)，证明NLRZM基因是LrZH22。
图8 抗叶锈病基因LrZH22的转基因功能验证(Yan et al. 2021)
为了克隆els1基因，利用小麦叶衰系M114(图2)与正常系W301构建精细定位群体，应用els1侧翼分子标记WGGB306和WGGB307从3453个单株F2群体中筛选出266个标记间重组单株，通过对其后代家系田间的叶片坏死表型精准鉴定，最终将els1基因锁定在分子标记WGGB618和WGGB476之间0.07 cM遗传区间，并与WGGB302和WGGB466共分离，对应中国春2BS染色体1.7 Mb基因组区段，可注释出17个高可信度基因，与LrZH22定位区间重叠(图5)。M114和W301的叶片RNA-Seq结果表明，定位区间这17个预测的基因中有9个表达，与expVIP数据库(www.wheat-expression.com)的结果基本一致。在M114和W301间仅在定位区间4个表达的基因上检测到序列变异，鉴于小麦NLR蛋白可介导程序化细胞死亡引起植株坏死(Jia et al. 2021)，推测小麦早衰品系M114中的NLRM114是els1的候选基因。序列比较发现，M114与周麦22具有完全相同的NLR基因序列，说明M114含有LrZH22/Lr13/els1基因，表现对叶锈病菌FHDS的抗性(图4)，但感叶锈病菌FHDS的W301和郑州5389间存在较多的序列变异。
4. LrZH22和els1介导杂种坏死的遗传验证
杂种坏死是植物杂交后代F1或F2出现叶片或整株不同程度坏死的生物学现象，在拟南芥、水稻和棉花等植物中均有报道，并且发现控制杂种坏死的基因多为参与抗病防御类型的基因，如NLR蛋白等。普通小麦中存在两个互补的杂种致死基因Ne1和Ne2(Caldwell和Compton 1943)，分别位于染色体臂5BL和2BS上(Chu et al. 2006)。在普通小麦品种间杂交时，同时携带Ne1和Ne2的植株在苗期至成株期表现出渐进性的细胞死亡和丰富的活性氧积累，表现出不同程度的杂种坏死表型。在Ne2基因区段还定位有抗叶锈病基因Lr13，澳大利亚悉尼大学的Bob McIntosh教授和张鹏博士等人利用突变体分析发现Lr13可能与杂种坏死基因Ne2m位于同一个座位(Zhang et al. 2016)。因此，推断LrZH22和els1可能与Lr13/Ne2位于相同的基因座位。为证实这一假设，利用NLRZM超量表达纯合转基因系OE-T1-1-1、周麦22及感叶锈病突变体EM6和转基因受体品种Fielder分别与小麦品系M114(早衰)和W301配制不同的杂交组合，验证LrZH22和els1与杂种坏死的遗传关系。结果表明，Fielder X M114和Fielder X W301杂种F1均叶片正常，OE-T1-1-1 X M114和OE-T1-1-1 X W301杂种F1均叶片坏死；突变体EM6 X M114杂种F1叶片正常，而周麦22 X M114杂种F1叶片坏死(图9)，表明LrZH22和els1就是小麦杂种坏死基因Ne2m。
图9 LrZH22和els1介导杂种坏死的遗传验证(Yan et al. 2021)
5. LrZH22/Lr13的单倍型变异
为明确抗叶锈病基因LrZH22与Lr13的异同，比较了周麦22与Lr13基因载体品种Manitou和RL4031，以及其它小麦品种中该NLR基因的序列。结果发现，周麦22与Manitou和RL4031具有完全相同的NLR基因序列，表明LrZH22就是Lr13基因。但在较高的温度条件下，周麦22均比Manitou和RL4031表现较强的叶锈病抗性(图10)，说明LrZH22/Lr13是一个受遗传背景影响的高温抗叶锈病基因。
图10 抗叶锈病基因LrZH22/Lr13对温度的响应和抗性表达差异(Yan et al. 2021)
进一步对LrZH22/els1/Lr13/Ne2编码的NLR蛋白进行了单倍型分析，结果发现周8425B、周麦11、周麦22、周麦25、周麦28、周麦30、周麦36、周麦37、周麦38、周麦40、周麦45、周麦49、周麦51、04中36、农大211、农大212、鲁麦21、烟农15、烟农23、良星99、汶农14、济麦19、济麦20和克丰3号等小麦品种(系)中均携带该抗叶锈病基因(图11)，说明其已被我国小麦育种家成功利用，育成多个高产抗病品种，对我国小麦叶锈病的控制做出了重要贡献。
图11 含有抗叶锈病基因LrZH22/Lr13的部分小麦品种(Yan et al. 2021)
我们通过分子设计，在持久多抗基因Yr30/Lr27基础上，聚合高温抗叶锈病基因LrZH22/Lr13和成株期抗条锈病基因YrZH22，育成高产多抗小麦新品种科麦1609(图12)，表现出突出的叶锈病和条锈病抗性。已经通过了2021年第八届河南省主要农作物品种审定委员会第九次审定会议初审。
图12 含有抗叶锈病基因LrZH22/Lr13的高产多抗小麦新品种科麦1609
与所有的感叶锈病单倍型相比，在抗叶锈病等位基因上存在两个特异的单核苷酸变异(SNV)位点T1308G和A1684C。连续三年(2015/2016、2016/2017和2017/2018)两点(河北保定和河南周口)对390份材料构建的自然群体成株期鉴定结果表明，抗病单倍型(TA)叶锈病严重度显著低于感病单倍型(GC)。根据其中的A1684C位点开发出一个CAPS功能标记HBAU-LrZH22(图13)，可以特异检测种质资源中的LrZH22/Lr13抗叶锈病基因，应用于小麦抗叶锈病分子育种。由于LrZH22/Lr13/Ne2/els1基因与含有Ne1基因的小麦品种配制杂交组合时会导致杂种坏死，在育种实践中应尽量避免组配Ne1 X Ne2的杂交组合，以便充分利用LrZH22/Lr13/Ne2/els1基因的抗叶锈病功能，选育抗病优良新品种。
图13 小麦抗叶锈病基因LrZH22/Lr13的CAPS标记(Yan et al. 2021)
5. LrZH22/Lr13/Ne2/els1基因克隆后记
LrZH22/Lr13/Ne2/els1基因克隆工作由河北农业大学李在峰和刘大群教授研究团队与中国科学院遗传发育生物学研究所刘志勇研究员课题组联合河南农业大学殷贵鸿教授和澳大利亚CSIRO张建萍博士合作完成。课题组起初利用不同的材料对叶锈病抗性和叶片早衰性状进行研究，在发现LrZH22基因与叶片早衰基因els1的定位区间相互重叠后，经过认真的分析比较，协调和整合优势资源合作开展了后续的研究工作，利用图位克隆和MutRenSeq两种策略相互验证，成功克隆了周麦22的抗叶锈病基因LrZH22，并明确了其与抗叶锈病基因Lr13、杂种坏死基因Ne2和叶片早衰基因els的关系。该基因的克隆为进一步揭示小麦寄主免疫和程序性细胞死亡的分子机制奠定了基础，也为小麦抗叶锈病分子育种提供了重要的基因资源和功能标记。在开展相关研究期间，李淼淼博士els1基因定位论文(Li et al. 2018)投稿到Crop Journal杂志请澳大利亚悉尼大学的Bob McIntosh教授进行英文润色，他敏锐地意识到els1基因可能与他们正在研究的Lr13/Ne2基因间的相关性，并利用其中与NB-ARC基因共分离的分子标记WGGB302分析了他们的Lr13/Ne2遗传材料，证实该NB-ARC基因是Lr13/Ne2重要的候选基因。经与澳大利亚Bob McIntosh教授、张鹏博士和Evans Lagudah博士研究团队多次工作进展交流、信息分享、协商和研讨，中澳双方决定分别以所用的研究材料为重点，分头推进LrZH22/Lr13/Ne2/els1基因的克隆和功能验证工作，最后双方的研究结果得以背靠背的形式同时在Molecular Plant杂志发表(Hewitt et al. 2021; Yan et al. 2021)。在研究工作阶段性完成之际，我们深刻认识到国内外团队间开放、交流、团结、合作的重要性和必要性。在小麦功能基因组研究突飞猛进之际，越来越多的团队和课题组的研究工作可能会发生交叉重叠，期望大家能不断实现团结协作，互利共赢！
参考文献
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