科研 | PNAS：植物气孔发育的miRNA调控机制
编译：Yong-qin，编辑：十九、江舜尧。
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气孔是植物表皮的一对保卫细胞（GCs）形成的微孔，控制着植物与大气间的气体交换和水分流失，其分布和密度受植物发育和环境的调控。气孔世系由三种bHLH型转录因子调控（SPCH、MUTE、FAMA），涉及裂原活化蛋白（MAP）激酶通路和小肽信号通路。在植物中，miRNA由premiRNA经过DCL1蛋白剪接形成，成熟miRNA被HEN1甲基化并通过AGO蛋白装载至RISC（RNA诱导的沉默复合物），抑制靶基因表达。研究已表明，miRNA突变体dcl1或ago1导致植物气孔密度变化，然而涉及的miRNA序列仍未知。本研究利用拟南芥AGO1突变体筛选与之关联的miRNA，RNA-seq分析miRNA在气孔发育过程中的表达模式，并预测其靶基因。本研究发现miR399介导的PHO2（磷酸盐代谢调节）调控参与控制气孔发育。
论文ID
原名：Regulation of stomatal development by stomatal lineage miRNAs
译名：植物气孔发育的miRNA调控机制
期刊：PNAS（Proceedings of the National Academy of Sciences）
IF：9.58
发表时间：2020.3
通讯作者：Yunju Kim
通讯作者单位：韩国基础科学研究所
DOI号：https://doi.org/10.1073/pnas.1919722117
实验设计
① 植物材料。拟南芥（Arabidopsis thaliana ecotype Col-0），转基因采用农杆菌转化法与浸花法。基于AGO1的GFP标记，用共聚焦扫描显微镜聚焦检验幼苗。
② 蛋白质印迹分析。SDS-PAGE法提取蛋白质，用eGFP标记抗体结合GFP，Supersignal West Pico Chemiluminescent Substrate检测发光信号。
③ 总RNA提取与RT-qPCR。TRIzol法提取RNA，反转录第一链cDNA，SYBR Green qPCR以ACTIN2为内参。
④ miRNA免疫沉淀与分离。基于GFP抗体（与AGO1-GFP结合）沉淀miRNA复合物，Zymo试剂盒分离miRNA。
⑤ miRNA测序与分析。将分离的miRNA建立145-160bp的cDNA文库，Illumina Hiseq2500进行单末端50bp测序。Bowte1进行参考基因组TAIR10比对，计算各基因位点的RPM，利用碱基配对关系和相反表达模式预测miRNA的靶基因（Small RNA Target Prediction tool、imiRTP、psRNATarget），并进行相关性分析。筛选的靶基因进行GOBP富集分析。
结果
1、气孔发育相关的基因表达谱
bHLH转录因子SPCH、MUTE、FAMA在气孔发育的不同阶段特异性表达，有序地调控气孔细胞发育，EPF1/2是调控气孔模式的多肽配体（Fig. 1A）。共聚焦显微镜验证了promoter::GFP-AGO1DAH的表达，表明SPCH在初始分生组织时表达，MUTE在拟分生组织阶段表达，FAMA在形成保卫细胞时表达（Fig. 1B）。RNA-seq测出的427个MIR中，266个（62.3%）在气孔发育阶段表达，且成熟的miRNA位于266个MIR基因序列的中心位置（Fig. 1C）。主成分分析表明，MUTE-FAMA与EPF2-EPF1调控的miRNA表达谱差异差异较大，且FAMA期和EPF1期的重复样品间miRNA表达存在差异（Fig. 1D），表明气孔世系中可能存在不同的miRNA调控程序。
2、气孔发育过程miRNA表达谱
本研究通过RNA-seq鉴定出224个差异表达的miRNA，按照气孔三个发育阶段分组，有两组在SPCH/EPF2时期高表达，约2/3的差异基因在气孔入口形成阶段高表达（Fig. 2A），其中65个miRNA在SPCH–MUTE–FAMA和EPF2–EPF1通路共表达，而在气孔细胞分化阶段，仅24个miRNA共表达（Fig. 2B），可推测在细胞分化阶段miRNA表达模式发生明显变化。
为验证miRNA的差异表达，利用miRNA启动子驱动GFP报告基因进行转基因。结果表明，miR165a和miR157d气孔口形成阶段表达，其中miR165a在表皮细胞表达（Fig. 2C），miR157d在分生组织表达（Fig. 2D）。miR167c在分化阶段表达（Fig. 2E）。
3、miRNA对气孔发育的调控
本研究选择3个差异表达miRNA（miR829、miR861、miR3932），分析其对气孔表型的影响。结果表明，miR829过表达使气孔数量明显增多（Fig. 3A and D），而miR3932使成对存在的气孔对数量增加（Fig. 3B and E），miR861的过表达不影响气孔发育，但抑制其表达会增加气孔数量（Fig. 3C and F）。
根据差异表达的miRNAs及RNA-seq预测潜在的mRNA靶标，本试验试验筛选了868个潜在的mRNA靶标（553个在气孔形成期表达，105个分化阶段表达），富集分析表明miRNA调控mRNA修饰、蛋白质蛋白质修饰和运输的生物学功能的基因，此外包括营养调节、防卫反应、温度响应的基因（Fig. 4A）。通过构建的调控模型，发现10个miRNA调控大量的靶基因（Fig. 4B）。
从10个候选的miRNA中选择气孔形成期表达的MiR399，预测其调节E2泛素化连接酶PHO2和磷酸转运蛋白PHT1，在植物磷酸盐调节中发挥作用。MiR399基因家族包括6个基因，miR399b和miR399c均在气孔形成期的表皮细胞高度表达（Fig. 5A），且miR399与PHO2的表达模式相反（Fig. 5B），且miR399b的过表达和pho2的突变均导致植物气孔数量、气孔簇、气孔密度的增加（Fig. 5C and D and E）。且miR399b使SPCH、EPF2、TMM转录水平显著上调（Fig. 5F），使PHO2 mRNA裂解（Fig. 5G），表明miR399介导了PHO2对气孔发育的调控。
讨论
先前研究阐明miRNA参与气孔发育的调控，但具体的miRNA及其调控机制仍不清楚。本研究证明了miRNA的动态表达，并阐明其与bHLH转录因子的作用，表明miRNA的差异表达在气孔世系细胞的发育与分化过程起重要作用。植物光合作用依赖于高效的气体交换和水分利用，气孔的密度和模式对维持平衡十分重要，miRNA的存在表明植物存在新型调控通路，确保表皮结构的高效调控。
评论
气孔细胞的发育模式由关键的转录因子调节，是植物的生长和生存的关键。本研究确定了miRNA在气孔发育过程的动态表达谱，表明miRNA存在正向和负向调控，并系统阐述miRNA参与的气孔发育调控网络。这些结论使miRNA在植物发育中的重要性被深刻认知，为miRNA的研究提供参考。
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