western blot条带跑不出来，知道这些轻松搞定western条带
做过western的朋友经常会说，出不出条带是一门“玄学”，步骤都对，为什么出不来想要的结果？
看着别人的条带是这样的
而自己跑的条带是这样的
这样的
以及这样的
羡慕别人的同时，有没有想跑出好看的条带呢，这里小编总结了western条带会出现的常见现象，原因以及相应的解决办法。
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现象 |
原因 |
解决办法 |
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一抗二抗宿主不同 |
确定一抗是来自兔还是鼠，使用对应二抗 |
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组织中目的蛋白含量低 |
浓缩，放大信号 |
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蛋白量不足 |
蛋白量在30-40ug中间，使用蛋白酶抑制剂设置阳性对照 |
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转膜不成功 |
减少电流，延长时间，多加5-10%甲醇溶液，活化PVDF膜 |
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抗体浓度不合适 |
设置浓度梯度，根据结果选择合适的浓度，调整孵育时间 |
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洗膜时间过长 |
经验值5次，每次5min，根据实际情况有所改变 |
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一抗不识别待检物种蛋白 |
对比免疫原序列和蛋白序列，确定抗体能与目的蛋白发生反应 |
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封闭时间过长目标蛋白不显色 |
减少封闭时间 |
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叠氮钠对二抗产生抑制 |
叠氮钠不要和HRP标记抗体一起使用 |
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条带背景过高 |
膜干燥 |
保证膜和充分的反应液接触 |
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封闭时间不够 |
延长封闭时间 |
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抗体浓度过高 |
稀释抗体并延长孵育时间 |
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孵育温度过高 |
4°C孵育 |
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未结合蛋白没有洗干净 |
增加洗膜次数 |
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出现杂带 |
蛋白降解 |
加入蛋白酶抑制剂 |
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一抗浓度过高 |
降低一抗浓度 |
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二抗浓度过高产生非特异结合 |
降低二抗浓度 |
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蛋白样本具有多种修饰形式（乙酰化，糖基化，磷酸化等） |
去修饰后验证 |
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出现目的蛋白多聚体 |
增加样品煮沸时间使蛋白充分解聚 |
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细胞传代多导致蛋白表达不同 |
未传代细胞做对照 |
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不是纯化抗体 |
使用亲和纯化的抗体 |
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背景有斑点 |
抗体结合封闭液导致黑色斑点 |
更换封闭液 |
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转膜时候有气泡出现白色斑点 |
转膜时用滚轴将气泡赶出 |
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抗体在膜上分布不均匀出现白色斑点 |
使用滚轴孵育，保持摇动 |
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白条带或者条带有空斑 |
抗体浓度过高 |
降低抗体浓度 |
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条带“凹”形 |
电泳温度高改变迁移速率和pH |
4°C低温电泳 |
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胶冷却不均匀 |
配胶时注意均匀 |
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条带“凸”形 |
凝胶和玻璃挡板底部有气泡 |
配胶注意除气泡 |
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拖尾 |
蛋白了太大 |
调整蛋白量 |
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一抗浓度和时间太长 |
减少一抗浓度和时间 |
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含有较多非蛋白大分子杂质 |
更换样品 |
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非均一性背景 |
膜干燥 |
保证膜和充分的反应液接触 |
Western实验步骤比较繁琐，细节决定成败，在实验过程中还要根据实际情况随时调整，最后，小编在这里祝大家实验顺利，多出条带。
END
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