【专家论坛】便携式病原微生物分子诊断技术应用现状和展望
文章来源：中华检验医学杂志, 2021,44(2) : 94-99
作者：余方友 王冰洁
摘要
病原微生物导致的感染严重威胁人类公共卫生。便携式病原微生物分子诊断技术能够快速准确地检出病原体，在提高基层医疗机构和现场检疫方面发挥重要作用。本文概览了便携式病原微生物分子诊断的技术和产品要求，重点介绍了国内外已上市或正在上市的便携式病原微生物分子诊断仪器特性和应用领域，存在的缺陷及应用展望。随着技术的发展和持续优化，便携式病原微生物分子诊断仪器在保证高性能的同时，提高质量控制并控制成本，将有利于更广泛的应用。
病原微生物，特别是高致病性病原微生物导致的感染对人类公共卫生造成了巨大威胁。新发突发传染病如高致病性禽流感、登革热、埃博拉病毒感染、正在全球蔓延的新型冠状病毒肺炎（COVID-19）等以及各种耐药病原体严重威胁人类健康。据估计，全球每年发生约15亿例微生物感染，并导致460万人死亡［1］。快速、准确地诊断感染性疾病对精准治疗和及时采取正确的防控措施具有重要的指导意义，在控制感染性疾病，特别是重大的公共卫生事件中发挥关键作用。目前，常用的传统病原微生物检测方法主要有染色涂片检测、病原体培养、病原体抗原和抗体检测等，这些方法存在敏感度和特异度低及耗时长等缺点。近年来，分子生物学方法发展迅速，日益成为感染性疾病快速诊断的主要方法，特别是普通实验室难以培养、生长缓慢、罕见病原体等检测方面具有较明显的优势，如新型冠状病毒（2019 novel coronavirus，2019-nCoV）感染主要依靠分子生物学检测进行确诊。但分子生物学检测方法存在实验室条件要求高，需要特殊设备，人员专业素质要求高，难以发现新发传染病病原体等缺点。近年来，迅速发展起来的病原微生物宏基因二代测序技术（metagenomics next-generation sequencing，mNGS）在感染性疾病的诊断，特别是新发传染病的诊断中发挥重要作用，越来越受到关注。但mNGS存在检测时间长，费用高，需要贵重的测序仪及熟练的生物信息学分析专家，检测结果难以标准化，结果分析困难等缺点。
现场检验（point-of-care testing，POCT）亦称床旁检验，是由美国实验室标准化委员会提出的概念，主要指在实验室以外的现场，利用便携式分析仪器及配套试剂进行快速检测的一种方式，具有周转时间短、操作简便、便携化、智能化等优点。POCT检测项目广泛，但在常规临床应用中主要局限在病原体抗原抗体或细胞因子等方面的检测，在病原微生物核酸检测方面应用有限。近年来便携式病原微生物分子诊断技术已有成熟的产品，有望成为传染病病原POCT的有力工具。
一、理想的便携式病原微生物分子诊断技术要求
便携式病原微生物分子诊断技术的理想条件是可以接受未经处理的样本或自带自动化处理装置，实现“样品进-结果出”检测，在无需额外的设备与试验条件及对操作者专业素质要求不高的情况下，能在短时间内提供完全解释的结果［2］。“样品进-结果出”的分子诊断技术需要全封闭一体化的检测系统，整合核酸提取、核酸扩增、核酸检测和结果分析，最大限度地减少人工处理造成的错误和污染风险，达到操作简便的目的。同时，便携式病原微生物分子诊断技术需适合多种不同的条件下进行检测，如不同的自然条件下，甚至恶劣的自然条件下可正常使用，这些自然条件包括不同大气压、湿度和气温的检测场合、还包括不同天气情况下的室外检测场合。便携式病原微生物分子诊断技术所需的检测设备除了满足上述条件外还需体积小、重量轻（最好轻于1 kg），便于携带，自带电源且蓄电时间长，可云端连接传输数据且有相对大的数据存储功能。便携式病原微生物分子诊断技术所需的检测试剂应无需冷链运输与保存，试剂性能稳定且有效期长，单个检测包装，所需所有试剂混合在一起，最好为卡盒式。大部分便携式病原微生物分子诊断技术基于实时荧光定量PCR（real time polymerase chain reaction，RT-PCR）技术，通过扩增体系的优化，温控系统的结构设计可加快反应速度。此外快速核酸扩增技术的应用，如环介导等温扩增技术、重组酶聚合酶技术等不需要复杂的热循环系统，可将反应时间缩短到十几分钟。简化样本检测流程、缩短检测时间是快速检测的主要优化途径。另外在成本方面，单样本检测成本的控制有利于在基层医疗机构的广泛应用。
二、现有国内外上市或正在上市的便携式病原微生物分子诊断技术简介
微流控技术的迅猛发展使传统的大型诊断仪器逐渐实现小型化、集成化、自动化，使样本处理与分析摆脱了大型实验室的限制。Cepheid公司开发的GeneXpert Edge平台体积小重量轻，由电池供电可持续运行近6 h，可用于资源有限地区的检测［3］。另外它可以储存多达2万条检测结果，单个样本检测需80 min。该公司2015年公布的GeneXpert Omni平台更为便携，在重量、体积、电池续航以及数据传输能力方面均有较大的提升，预计在最偏远的地区以及室外环境有广泛的应用前景，但目前仍在推迟上市。Xpert系统目前已经覆盖多种传染病检测项目，其中结核分枝杆菌检测试剂盒MTB/RIF应用最为广泛，可从患者痰液中检测是否含有结核分枝杆菌及利福平耐药基因，为世界卫生组织推荐的结核病分子诊断方法［4, 5, 6］。二代Xpert MTB/RIF Ultra试剂盒具有更高的灵敏度（15.6 CFU/ml），对低含菌量标本的检测性能明显提高［5］。
Cobas Liat平台基于实时定量PCR/实时定量逆转录PCR检测DNA/RNA靶标，基于特殊的气压微流控芯片结构及空间温控，大大加快PCR扩增过程，检测时间仅为15~20 min。ID Now平台曾以Alerei被熟知，基于Nicking酶扩增反应技术和恒温扩增技术，摒弃传统核酸扩增技术复杂的热循环，可在很窄的温度范围内进行靶标的迅速放大，检测时间更短，仅需5~13 min。但由于快速核酸放大技术的局限性，该仪器不能进行多靶标检测［7］。Cobas Liat和ID Now仪器均具有一定的便携性，适用于诊所、医院急诊等多种医疗场景。但对环境稳定要求较为严格，在室外使用有一定限制。两者在呼吸道病原体快速检测上应用广泛［8］，其中Alere i A/B流感检测是首个获得美国临床实验室改进修正案批准的分子诊断POCT技术，而后Cobas Liat仪器也经过广泛验证，多个检测项目均获得了美国临床实验室改进修正案豁免。Cobas Liat系统在检测艰难梭菌方面与中心实验室Xpert检测有较好的一致性，为艰难梭菌快速检测提供了可能［9］。
m-PIMA平台在被雅培公司收购前曾命名为Alere q，主要基于多重实时定量PCR技术检测。该仪器标本处理流程简单，只需要25 μl血液（手指或脚趾）即可在52 min内提供检测结果。另外其工作环境条件灵活，可在较宽的环境温度范围内运行，且可适应高达85%的工作湿度，在恶劣环境如高海拔等地区应用优势明显。目前唯一可用的检测方法是Alere q 人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus-1/2，HIV-1/2）检测，对婴儿HIV早期诊断具有重要意义［10］。
上述检测仪器占地面积小移动性强，具有高度便携的优点，但在检测通量及检测靶标方面较为单一。这些仪器可以随到随检，在基层医疗机构的中低量样本日常检测中具有很大的应用价值，但在感染高发季如流感病毒流行期，高通量多靶标的平台更具优势。Filmarray平台是典型的高通量多靶标平台，基于巢氏多重PCR，通过独特的微流控腔室结构，可对每个样本检测多达27个靶标，检测时间为45~60 min。该仪器体积重量小，可同时连接多台仪器达到高通量的目的。目前有通用的呼吸道感染检测卡、血液感染检测卡、胃肠道感染检测卡、脑膜炎感染检测卡，病原检测范围十分广泛。
国内便携式POCT发展起步较晚，但近年来发展势头迅猛。如圣湘、优思达等开发的便携式全自动核酸检测系统在核酸提取及核酸检测上多有技术创新。圣湘iPonatic便携式全自动核酸检测系统采用实时PCR技术结合专利的一步法核酸免提取技术，大大缩短了检测时间，15~45 min即可完成检测。该仪器检测主要针对肝炎病毒、人乳头瘤病毒等，均已获得国家药监局审批。基于该系统的2019-nCoV试剂盒，最低检测限为200拷贝数/ml，与传统PCR仪相比其敏感度和特异度都在99%以上，已在全球多个国家的医疗机构门诊和实验室使用。优思达Easy NAT平台采用创新的交叉引物恒温扩增实时荧光技术。对环境要求灵活，4~40 ℃下均能运行，可适应高达95%的工作湿度，另外其配套试剂进行了玻璃化处理，可在常温下运输和保存，因此在室外环境及移动环境的使用中具有较强的优势。基于该系统的2019-nCoV检测试剂盒是首个国家批准的2019-nCoV核酸检测POCT试剂，另外还包括结核分枝杆菌检测试剂盒，检测需要80~90 min。另外卡尤迪Flash20检测系统和遂真LifeReady1000系统也进行了技术的创新，分别采用分子并行反应和卡式实时PCR技术，使检测时间大大缩短。这两个系统均具有4个独立反应模块，通量较为灵活。在高通量多靶标检测方面，万孚BoxArray核酸检测分析系统的检测卡每样本检测多达30种靶标，最多可同时检测48个样本。但该系统检测样本处理及样本分析需要独立的模块，仪器体积相对较大，检测时间较长（3.5~4.5 h）。其检测项目覆盖广泛，包括血流感染、呼吸道感染病原检测等。上述国内外便携式病原微生物分子检测系统性能比较见表1。由于国内此类产品大多数是在COVID-19疫情背景下获得国家相关部门批准运用于临床检测，其性能还有待临床进一步验证，与国外同类产品的性能比较也需要大量的临床试验进行验证。
三、便携式病原微生物分子诊断技术的应用现状
在病毒检测方面，现有的便携式病原微生物分子诊断技术的验证及应用较为广泛。呼吸道病毒是最常见的感染和死亡原因之一。研究显示对呼吸道病毒进行POCT诊断可以减少抗菌药物的过度使用、促进抗病毒治疗的合理选择及感控措施的有效实施［7， 11, 12］。Cobas Liat系统和ID Now系统对于A/B型流感病毒和呼吸道合胞病毒的检测在基层医疗机构和医院门急诊的应用中得到了广泛的验证，其特异性和敏感性与中心实验室实时PCR检测相当［13, 14, 15］。但由于流感病毒基因组的快速变异，这些检测对新出现的H3N2 A型流感敏感性下降，因此对病毒流行株的持续监测可能是保持检测性能的关键［16］。另外在混合感染中的呼吸道病毒检测存在假阴性的风险，因此在临床使用中阴性结果不能排除呼吸道病毒的感染，应结合多方面因素做综合判断。
在资源匮乏的发展中国家，HIV感染或携带可能是感染性疾病防控的巨大挑战。研究显示全球有4 000多万人感染艾滋病毒，85%的患者来自发展中国家，缺乏实验室以及高周转时间导致了不知情传播风险的增加和抗逆转录病毒治疗的延迟［17］。迫切需要操作简单、低成本并具有高敏感度和高特异度的便携式POCT检测平台。Xpert HIV-1 Qual 和Alere q HIV1/2在2016年均进入了世界卫生组织的资格预审。一项坦桑尼亚评估显示Xpert HIV-1 Qual在从出生到6周的婴儿检测中表现出较高的敏感度和特异度，有利于早期诊断和及时抗逆转录病毒治疗［18］。Alere q HIV 1/2检测最低检测限为800~1 000拷贝数/ml，是唯一可以检测HIV-2的便携式POCT检测，但是其检测性能稍低于Xpert HIV-1 Qual，原因可能是Alere q HIV 1/2检测使用全血标本且样本量少，在低病毒载量下较使血浆标本提取DNA更为困难。如何在保证尽可能简便地样本处理的同时实现较高的灵敏度是HIV快速检测面临的挑战。
便携式病原微生物分子诊断技术在突发公共卫生事件的现场检疫中有很高的应用价值。埃博拉在全球范围内不断暴发，在最近的刚果疫情中的应用已经证明了POCT在新发突发传染病防控中的必要性［19］。在当前COVID-19疫情已波及全球240多个国家的背景下，出于对疫情防控的要求，多个快速核酸检测试剂盒通过国家应急审批，如上述的优思达、卡尤迪等，极大推动了国内POCT分子诊断的开发及应用。通过将快速检测的便携式病原微生物分子诊断仪器放置在一线，可有限解决基层及分散环境中疫情诊断的难题。最近，国家相关部门要求发热门诊就诊患者的新型冠状病毒检测报告需在4~6 h内完成，争取4 h完成，随着防疫形势的新变化和新要求，便携式病原微生物分子诊断技术是不错的选择，可以快速完成新型冠状病毒检测，满足疫情防控要求。然而大多数检测试剂盒性能验证和临床应用评估十分有限，且目前所用试剂盒最低检出限大多在400~1 000拷贝数/ml，灵敏度不足［20, 21］。引起高度关注的ID Now新型冠状病毒检测相关评估显示，其检测时间较为快速（低至17 min），但检测性能有较大的损失（最低检测限仅为20 000拷贝数/ml），在如今大流行中可能易发生漏检［22］。另外有报道显示在与流感病毒合并感染中，多个检测试剂盒均出现假阴性的结果［23］。因此出于谨慎考虑，目前新型冠状病毒检测应以实验室集中实时RT-PCR检测为主，便携式新型冠状病毒POCT检测定位于实验室外的实时快速筛查，仍需进一步的性能优化和评估。
在细菌及耐药性检测方面，结核分枝杆菌及利福平耐药性检测是成功应用的经典案例。研究显示在分散环境使用中使用Xpert MIB/RIF检测需要的成本较中心实验室成本稍高，但有利于更快地开展正确的抗结核治疗［24, 25］。目前基于GeneXpert Edge的MTB/RIF诊断技术已列入印度结核病根除计划和非洲结核病项目。在多重耐药菌常见菌检测方面，Renner等［1］开发了一种基于重组酶聚合酶扩增和微流控的小型便携式分子诊断设备，可以快速检测ESKPA（粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌属）病原体。另外在胃肠道病原体、A/B组beta溶血链球菌检测方面也有较好的应用［26］。
四、便携式病原微生物分子诊断技术的不足及应用展望
便携式病原微生物分子诊断技术在快速检测病原微生物方面具有明显优势，特别是在应对突发的群体性感染性疾病时发挥了重要作用。但该技术还存在单次检测通量低，单次检测病原体靶标不够多，检测灵敏度不够高，检测数据存储量不够大，检测环境要求不够宽，智能化程度不够高、检测速度还不够快等缺点。现有的便携式诊断技术产品各自具有不同的优点和不足，或注重可移动性和环境适应性，或强调快速、短时间获得结果，或侧重高通量多靶标检测。不同特性的产品适合不同的场景。有些产品，特别是国内最近获得批准用于临床检测的产品的性能还没有得到充分的验证。另外，国内相关管理部门对便携式病原微生物分子诊断技术的性能要求、质量控制、检测适用范围、检测条件等暂无相应的法规，导致这些技术的应用受到一定的限制。
未来微生物实验室将呈现出两极分化的特点，一种是大型实验室的流水线式集中检测，具有高通量、低成本的优点。一种是分散环境的快速检测，可短时间内获得检测结果，适用于广泛移动场景。便携式病原微生物分子诊断技术定位于基层医疗机构及移动环境中的初级筛查，可作为中心实验室确诊的有力补充［27］。便携式病原微生物分子诊断技术的核心是实现整合一体化检测的同时，具有小型、简便、快速、适用于各种场景的特点。可以看到，便携式病原微生物分子诊断产品正朝着更加小型化、智能化、便携化、适用条件宽的方向发展。随着准确性的进一步提高，未来这类仪器可能会步入社区甚至家庭，通过云端连接医生诊疗系统，实现以患者为中心的个性化医疗模式。
参考文献（略）