编译：寒江雪，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
多环芳烃(PAH)是一种分布广泛、持久性强的环境污染物。它们在植物的不同发育阶段都有毒性作用。目前对植物对多环芳烃的防御机制知之甚少。本研究采用转录组学和广泛靶向代谢组测序方法，研究菲胁迫下沙柳根系基因表达和代谢产物的变化。分析处理组和对照组间基因和代谢物。菲上调了13种氨基酸，谷胱甘肽，硫代葡萄糖苷和类黄酮的生物合成。松属素、芹菜素和表没食子儿茶素含量增加，6种氨基酸和N、 N'-（p-香豆蔻酰基）-肉桂酰咖啡酰亚精胺水平显著增加，有助于保护植物免受菲胁迫。结果表明，沙柳对菲的攻击具有积极的防御策略。防御相关反应也可能在菲暴露后24小时内发生。本研究结果将有助于阐明调控植物对多环芳烃挑战反应的分子机制，并有助于指导作物和植物育种者提高对多环芳烃的抗性。
原名：Transcriptomic and metabolomic insights into the adaptive response of Salix viminalis to phenanthrene
译名：沙柳对菲适应性反应的转录学和代谢学研究
期刊：Chemosphere
IF：5.778
发表时间：2020.6
通讯作者：韩蕾
通讯作者单位：中国林科院林业研究所
DOI号：10.1016/j.chemosphere.2020.127573
本研究设置两个组别，1mg/L菲处理组和1mg/L甲醇处理的对照组。选取分别在浸泡24h和36h的根部组织，进行转录组和代谢组的测定。分析对照组和处理组不同时间点的差异表达基因和差异代谢物并进行功能注释和代谢通路分析。分析沙柳对菲胁迫后的防御响应分子机制及代谢途径。
1 菲胁迫下柳树根系基因表达和代谢途径的变化
图1展示了在菲暴露下，沙柳根中大量基因表达发生了显著改变。暴露24h，检测到2163个上调基因和2393个下调基因。暴露36h，检测到2250个上调和2615个下调基因。菲暴露24h和36h，2,176个基因的表达水平发生了显著变化，其中包括1,014个基因上调，1162个基因下调。对差异基因进行KEGG富集分析（图2），确定了39条差异显著的代谢通路。在暴露24h时，涉及到的途径包括：半胱氨酸、蛋氨酸和酪氨酸代谢；氨基酸和核苷酸的糖代谢；黄酮类化合物的生物合成；异喹啉生物碱的生物合成。在24h和36h中涉及到硫代谢；谷胱甘肽的生物合成；内质网与蛋白质加工；硫代葡萄糖苷的生物合成；牛磺酸和次牛磺酸代谢；托烷、哌啶和吡啶生物碱的生物合成。所有上调的代谢途径都与植物对胁迫的防御反应有关。植物能够调控基因的表达从而在菲胁迫下存活。虽然在菲暴露24h时诱导的基因比36h少，与应激防御反应相关的代谢途径在菲暴露24h比暴露36 h时上调的代谢途径多。因此沙柳对菲胁迫的防御相关反应在24h发生比较多。
图1菲暴露后的差异基因表达。
图2 CK与处理24h和36h存在显著差异的代谢途径。
2 应用qPCR进行RNA测序验证
为了验证RNA测序数据，随机选择不同代谢途径的19个基因进行qPCR验证（图3）。每个基因转录组数据的表达谱与qPCR获得的表达谱相似。因此，转录组测序数据是可靠的。
图3用qRT-PCR验证差异表达基因。
3 菲胁迫下柳树根系代谢的变化
本研究通过广泛非靶向代谢组学检测沙柳根中的810种代谢物。表1列出了显著差异的代谢物。图4展示了代谢物的变化趋势。90种代谢物（包括75种上调和15种下调）在菲暴露24h发生显著变化。暴露36h有79种代谢物（包括55种上调，24种下调）。在24h时主要是脂质被下调。36h时，脂质、氨基酸、核苷酸及其衍生物、有机酸及其衍生物、黄酮类化合物等均下调。结果表明，代谢物的抑制率随着菲暴露的增加而增加。这与转录组分析结果一致。
表1菲处理和对照组差异代谢物。
图4菲处理和对照组差异基因表达量热图。
4 菲胁迫下沙柳防御相关基因及代谢产物分析
将显著变化的代谢物与其相关的基因和途径结合后，发现沙柳的防御策略与促进氨基酸合成，增加碳水化合物，加强谷胱甘肽生物合成，上调硫代葡萄糖苷的生物合成，积累黄酮类化合物和其他次生代谢物有关。
4.1 氨基酸合成
氨基酸和蛋白质是含氮有机化合物，是环境胁迫下氮、硫代谢的主要产物。这些生物分子也是糖酵解、磷酸戊糖途径和三羧酸循环的中心，是许多次级代谢物(如谷胱甘肽、生物碱和牛磺酸)的前体，它们与逆境的反应有关。在菲胁迫24h和36h显著激活了13种氨基酸，同时其中的关键基因被上调（图5）。
图5氨基酸代谢的简化表示。
4.2 碳水化合物
植物对恶劣环境条件的适应需要大量的代谢能。肌醇半乳糖苷是一种常见的植物棉子糖和半乳糖苷供体。与对照相比，菲处理24h和36h的植株表现出显著的蔗糖、肌醇半乳糖苷和甘二糖积累（图6）。蔗糖磷酸合成酶(SPS)和蔗糖合成酶(SS)是高等植物蔗糖代谢的关键酶。蔗糖合成酶(Sus3)、磷酸蔗糖合成酶(SPS4)和蔗糖转运蛋白350(SWEET16和SUC2)在菲胁迫24h和36h均显著上调。此外，α-海藻糖酶、糖原磷酸化酶、4-α-葡聚糖转移酶、水苏糖合成酶和棉子糖合成酶在菲暴露24h和36h均相对上调。β-呋喃果糖苷酶(INV_1)和α-葡萄糖苷酶(Os06G0675700)在菲暴露24h后上调。研究表明，多环芳烃通过渗透细胞膜，促进细胞和组织中的氧化胁迫，降低植物水分和养分的利用效率。因此，几种糖及其相关基因的上调可能是对菲胁迫下渗透调节和高能需求的响应。
图6菲胁迫下的半乳糖代谢。
4.3 谷胱甘肽的生物合成
在植物中，异源解毒分三个阶段进行。细胞色素P450通常是第一解毒酶，而谷胱甘肽途径是第二阶段。谷胱甘肽途径的主要功能是催化具有高电子亲和力的环氧化物与谷胱甘肽的结合，以产生阻止多环芳烃环氧化物与DNA结合的谷胱甘肽结合剂。因此，谷胱甘肽在多环芳烃代谢中起着至关重要的解毒作用。谷胱甘肽也是一种关键的水溶性抗氧化剂，参与清除活性氧，其生物合成依赖于半胱氨酸、谷氨酸和甘氨酸。谷氨酸-谷氨酰-半胱氨酸是谷氨酸和半胱氨酸在谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化下通过ATP依赖的反应生成的。γ-EC与甘氨酸结合，生成谷胱甘肽。谷胱甘肽还原酶(GR)回收谷胱甘肽。在本研究中，与对照组相比，在菲暴露24h和36h后，谷氨酸半胱氨酸连接酶(GSH1)和谷胱甘肽还原酶(GR1)显著上调。此外，在菲暴露24h时，谷胱甘肽的含量相对增加。这个结果表明谷胱甘肽的合成被促进，并且其产物参与了对菲胁迫的抗氧化反应。谷胱甘肽-S-转移酶(GST)通过取代谷胱甘肽的亲电基团来解毒几种异源物质，如除草剂。GST在解毒甲基胆蒽反应性代谢产物中起主要作用。它通过介导催化谷胱甘肽结合随后排出，形成高度溶解的解毒复合物。与对照组相比，编码GST的基因，包括HSP26-A、PRP1、MGST3、GSTU7、GSTU8和P ARC，在菲暴露24h和36h显著上调。在菲胁迫下，GST活性和GSH产量增加，试图对异源生物进行解毒。
4.4 其他抗性途径的增强
多环芳烃暴露可诱导植物产生致病反应和抗性反应。前人研究报道，在菲胁迫下，拟南芥形成坏死损伤，发病相关蛋白PR1表达上调。对本研究中差异表达基因和代谢产物的分析表明，在菲胁迫下，与病原抗性相关的硫代葡萄糖苷和黄酮类化合物的合成上调。
4.4.1 硫代葡萄糖苷的生物合成
硫代葡萄糖苷是十字花科植物中的重要代谢物，具有抗癌和抗菌活性。硫代葡萄糖苷由脂肪族、芳香族和吲哚类硫代葡萄糖酸盐组成。硫代葡萄糖酸盐生物合成的三个阶段包括氨基酸转化为醛肟和侧链延长、核心硫代葡萄糖苷结构形成和侧链修饰。第一阶段是硫代葡萄糖苷生物合成的关键步骤，由植物细胞色素P450酶催化。CYP79A2将苯丙氨酸转化为苯乙醛肟，苯乙醛肟是苄基硫代葡萄糖苷的前体。接下来 CYP83A1和CYP83B1分别氧化脂肪族醛肟和芳香族醛肟。C-S裂解酶SUR1，葡萄糖转移酶UGT74B1和UGT74C1在硫代葡萄糖苷的生物合成中起关键作用。苯丙氨酸和酪氨酸水平显著增加。同时，菲暴露24h后，苯丙氨酸单加氧酶(CYP79A2，CYP83B1)和葡萄糖转移酶(UGT74B1)表达上调。因此，菲胁迫促进了芳香硫代葡萄糖苷的生物合成，促进了沙柳对病原菌的抗性。
4.4.2 黄酮类化合物的生物合成
植物中含有丰富的类黄酮。这些次生代谢物在生物学活性和生化多样性，包括花青素、黄酮醇、黄酮、黄烷酮、查尔酮、二氢查尔酮和二氢黄酮醇。黄酮类化合物可能使植物能够耐受富含有毒金属的土壤。与野生型相比，缺乏查尔酮合酶活性的透明种皮(tt4)突变体与野生型相比，生长素运输和生长表型均无变化。在目前的研究中，柚皮素3-双加氧酶(AN3)、黄烷酮4-还原酶(DFR)和亮花青素还原酶(LAR)在36h时显著上调（图7），松果膜蛋白含量是对照组的64.77倍。柚皮素转化为芹菜素，其含量是对照的434~2.85倍，木犀草素中和活性氧(ROS)可以缓解炎症，在人体内具有抗氧化和抗癌功效。松膜素和芹菜素具有菲胁迫下植物的ROS抑制效应。布丁和二氢槲皮素的减少归因于AN3和DFR介导的转化率的增加。表没食子儿茶素是二氢槲皮素的下游产物。菲处理24h后，其含量高出对照组。表没食子儿茶素在人体内发挥抗氧化和抗炎作用。本研究中其含量的增加可能是植物对菲胁迫的反应中的抗氧化反应。此外，在菲处理24h内，金莲花酚含量也增加了，这可能是沙柳对菲胁迫的防御策略。
图7菲胁迫下类黄酮的生物合成。
4.5 其他次生代谢物
有机酸在植物细胞和组织中维持电荷平衡和稳定的pH。在水分胁迫和重金属胁迫下，植物的有机酸含量增加。在本研究中，菲处理24 h时，6种有机酸的含量均比对照组含量高。包括戊二酸、6-氨基己酸、甲基丙二酸、氨基丙二酸、琥珀酸和香草醛。这些都可能与柳树根系适应菲胁迫的电荷平衡和稳定的pH有关。
脂质是重要的生理活性物质和信号分子。这些生物分子参与细胞代谢和能量储存，并稳定细胞骨架。本研究中，与对照组相比，在菲暴露24h时，6种脂质含量增加。膜脂质过氧化物也参与菲胁迫响应。α-亚麻酸含量的反应性增加可能对植物有益，因为这种脂肪酸是长链n-3多不饱和脂肪酸的前体，如廿烷五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）。
本研究首次将转录组学与代谢组学相结合，研究了沙柳(Salix Viminalis)对多环芳烃(PAH)中毒的防御机制。与对照相比，菲暴露24h后，根系中的基因表达和代谢产物发生了显著变化。13种氨基酸含量显著增加，半胱氨酸代谢显著增强，成为胁迫相关代谢物、渗透压调节和植物抗逆性所需能量燃料的必需前体。蔗糖、肌醇半乳糖苷和甘露糖是生物合成的主要碳水化合物，为植物提供响应菲胁迫的高能量水平。谷胱甘肽的生物合成得到增强，以实现活性氧清除和菲解毒。硫代葡萄糖苷合成和类黄酮生物合成的上调与抗氧化剂和病原菌的抗性密切相关。6种有机酸和N、N'-（p-香豆蔻酰基）-肉桂酰咖啡酰亚精胺含量增加，也参与了对菲胁迫的保护性/防御性反应。本研究利用转录组和代谢组测序分析沙柳受菲胁迫后根中基因表达和代谢物的相对差异。确定了参与植物多环芳烃防御反应显著差异的代谢途径及其关键基因。鉴定差异显著的代谢物并确定它们在多环芳烃胁迫耐受性中的生理作用。整合转录组和代谢组学数据阐明沙柳对菲胁迫的防御机制。该研究结果可为今后研究树木和农作物的抗药性研究奠定理论基础和实践经验。
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