科研|法国巴黎神经科学研究所Jean-René Martin: 肠内需要的小核仁RNA jouvence延长了果蝇的寿命

编译:Nicole,编辑:十九、江舜尧。

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导读

长寿受到遗传和环境因素影响,但其潜在机制仍尚未得到明确的解析。这篇论文在功能上表征了果蝇小核仁RNA(snoRNA)jouvence,其功能丧失会减少寿命。表达jouvence基因组区域可以挽救突变体的寿命,而过表达则可以延长寿命。肠上皮细胞需要jouvence,在突变体中肠道上皮表现出增生,而过表达jouvence防止增生。在分子上,发现突变体在18S和28S-rRNA上缺乏伪尿嘧啶化,而该功能可通过肠道中靶向表达jouvence恢复。从肠道进行的转录组分析显示,一些基因被上调或下调,同时恢复两个基因(ninaD或CG6296)的mRNA水平可以延长寿命。由于snoRNA在整个进化过程中在结构和功能上都非常保守,在包括人类在内的哺乳动物中鉴定出jouvence直系同源物,这表明其在长寿中的功能可能是保守的。10

论文ID

原名:Jouvence a small nucleolar RNA required in the gut extends lifespan in Drosophila

译名:肠内需要的小核仁RNA jouvence延长了果蝇的寿命

期刊: Nature Communications

IF:11.878(1区)

发表时间:2020.2.20

通讯作者: Jean-René Martin

通讯作者单位: 法国巴黎神经科学研究所

DOI号: 10.1038/s41467-020-14784-1

实验设计

首先对snoRNA: Ψ28S-1153及其相关基因进行了序列分析,鉴定其snoRNA特性。对其进行基因编辑,删除snoRNA: Ψ28S-1153后对果蝇日常饲养,检测寿命变化。对其进行了回补并将转基因品系与对照野生型杂交6次,然后与缺失snoRNA:Ψ28S-1153果蝇进行杂交,分别产生Del + rescue-1,-2,-3品系。分别比较这些品系雄性和雌性果蝇的寿命。

为了确定snoRNA表达位置,利用应该标记探针对多个遗传品系整个果蝇进行ISH标记。由于肠道上皮由四种细胞类型组成,分别使用特定细胞的启动子表达带有GFP的snoRNA,已确定snoRNA的具体定位

利用p [UAST-snoRNA-Ψ28S-1153](名为pUAS-jou8M)转入Myo1A-Gal4品系创制转基因品系将snoRNA靶向缺失背景中的肠上皮细胞,进一步利用RU486调控系统对组织特异性的基因表达进行调控,排除Myo1A-Gal4和Mex-Gal4在发育过程中对snoRNA的影响。利用ISH和定量PRC鉴定其表达,并比较其寿命变化。利用Northern blot检测不同品系及遗传操作下,不同位置的jouvence差异。

通过比较年轻(7天龄)和老龄(40天龄)的不同遗传操作下果蝇中肠细胞的数量,并利用不同的标记方法量化了肠干细胞(ISC)的数量和增殖以及ISC子细胞(成胚细胞:EBs)的错误分化,包括Delta-Gal4驱动pUAS-GFP-nls计算ISCs、抗PH3阳性细胞评估ISC的增殖、EdU标签(BrdU的最新更新替代品)标记分裂和核内复制细胞。为了评估jouvence是否影响核内复制,量化细胞核中DAPI染色荧光量,并RT-qPCR定量检测已知参与核内复制周期的主要基因之一Cyclin-E。

对野生型、jouvence缺失及诱导表达果蝇进行了RNA-seq转录组测序,比价表达差异大于2倍的基因,对其进行KEGG及KO分析,并通过RT-qPCR验证其表达模式。为了明确调控基因对寿命的作用,对其基因表达水平进行恢复,检测对寿命的影响,从而进一步确定jouvence的调控作用。为了阐明jou在应激反应中的作用,测试了转基因品系对干燥和饥饿的抵抗力。

利用BLAST和三级结构基序搜索(Infernal软件)进行的生物信息学,在果蝇、小鼠及人类中鉴定jou的同源物,并使用RT-PCR评估了人类和小鼠各种组织中的表达。

结果

snoRNA jouvence的遗传和分子表征

衰老涉及组织和感觉、运动功能的逐步下降和改变。在一项研究表征运动活动的基因中,重点研究了在中央复合体(CC)中表达的基因,对位于大脑中部的运动前中心进行了磷元素插入诱变,确定了增强子-陷阱轴P [GAL4] 4C,并表明靶向环状神经元的阻滞破坏了步行时间间隔的幂律分布。本文中进一步在分子上表征了P[Gal4]4C系,并在衰老的背景下,特别是在衰老对感觉运动功能的影响方面进行了研究。P[GAL4]4C插入第二个染色体上的两个假定基因CG13333和CG13334之间的位置50B1(图1a)。CG13333在胚胎中表达,而CG13334与乳酸脱氢酶基因部分同源。此外,一项生物信息学研究注释了CG13333和CG13334之间在P[GAL4]4C插入附近的snoRNA(snoRNA:Ψ28S-1153)(图1a),而最近的转录组分析已注释了另外两个假定的snoRNA(snoRNA:2R:9445205和snoRNA:2R:9445410)定位在第一个snoRNA:Ψ28S-1153的上游。但是,根据snoRNA的规范定义,其中H/ACA框形成发夹-铰链-发夹-尾部结构(图1d),而C/D框预测形成单个发夹结构,而这两个snoRNA不满足以上条件,表明它们可能不是真的或者至少不是规范的snoRNA。snoRNA:Ψ28S-1153形成典型的H/ACA双发夹(图1e)。为了在这个复杂的基因座中产生突变,使用切除基因的标准遗传方法删除了P[GAL4]4C,导致了632 bp缺失(F4)(简称:Del)(图1a),完全删除了snoRNA:Ψ28S-1153。利用RT-PCR测试缺失是否对两个编码相邻基因的表达有影响。结果表明与野生型(WT)的Canton-S(CS)蝇相比,这两个基因表达未发生变化。

涵盖snoRNA的基因组缺失会缩短寿命

有趣的是,对雌性进行的寿命测试(图1b)显示,与对照相比突变体蝇的寿命较短。为了测试snoRNA在长寿效应中的作用,创制3个转基因品系包含1723 bp的DNA片段,其中包含snoRNA的假定基因组和调控区(result-1、2和3)(图1a红色条),并测试其寿命。结果显示Del+rescue-1雌性的寿命恢复,而save-1系本身的寿命延长(图1b)。在另外两个独立的插入类型(result-2、result-3)也观察到了相似的结果(图1c)。最后,为了检查包含snoRNA:Ψ28S-1153的基因组区域的缺失是否存在两性异形,发现缺失后雄蝇的寿命更长。介于性别之间的寿命差异,本文首先研究雌性。

图1 P[Gal4]4C基因座的分子图和snoRNA:Ψ28S-1153的特征。A P[Gal4]4C基因座的基因组图。snoRNA:Ψ28S-1153(jouvence)以及其他两个假定的上游snoRNA(sno-2= snoRNA:2R:9445205和sno-3 = snoRNA:2R:9445410)及处于两个编码的相反方向基因:CG13333和CG13334。632 bp(红色虚线)的缺失(F4)包括3个推定的snoRNA。用于生成转基因果蝇的1723 bp基因组DNA片段(被基因组拯救的名称:rescue-1,rescue-2和rescue-3)(红线)。148 bp的snoRNA-jou片段(蓝色条)用于生成UAS-jou8M和pJFRC-MUH-jou1M构建体,与sno-2对应的166 bp片段(橙色条)和对应于sno-3的157 bp片段(粉红色条)。B对照组(CS)、Del(缺失F4)、Del +rescue1和rescue1的减少累积量。c与(b)相似,雌性Del(缺失F4)、Del + rescue-2、Del + rescue-3的累积量减少。d H/ACA snoRNAs结构的示意图。e snoRNA的示意图:15328S-1153(jouvence),具有典型的H / ACA盒结构。

snoRNA:Ψ28S-1153在肠道上皮细胞中表达

由于生物信息学研究仅snoRNA:Ψ28S-1153被鉴定为真正的snoRNA34,因此假设该snoRNA可能是该基因座中唯一具有功能性的snoRNA。为了确定snoRNA:Ψ28S-1153在哪些组织中表达,使用荧光标记的探针对整个果蝇进行了ISH(图2)。发现它在肠上皮核仁和前列腺中表达(图2a、c),在缺失系中不存在其表达(图2b、d)。此外DAPI复染表明它位于核仁中(图2c和d)。全身检查也显示snoRNA:Ψ28S-1153在对照组中也存在于卵巢营养细胞细胞核仁中(图2e、f、l和m),但在包括神经系统的其他任何组织中均未表达(见图2i、j、k)。类似地,当rescue与缺失系组合时,snoRNA:Ψ28S-1153的表达被限制在肠道上皮细胞中,但卵巢中没有(图2e、f)。对野生型果蝇的肠进行了ISH证实,snoRNA:Ψ28S-1153在中肠(图2g)中表达,但在后肠(图2h)中没有表达。这些结果表明,snoRNA:Ψ28S-1153寿命的影响可能是由于其在肠道上皮细胞而不是卵巢中的表达所致。肠道上皮由四种细胞类型组成:肠上皮细胞(ECs)、成肠细胞(EBs)、肠内分泌细胞(EEs)和肠干细胞(ISCs)。进一步验证发现其中只有EC特异性表达,表明其定位仅限于肠上皮细胞

图2 snoRNA:Ψ28S-1153(jou)在肠道上皮中表达。snoRNA-jou的原位杂交(ISH)在整个果蝇中显示在野生型对照中(a)在肠道上皮中有限制性表达(红色圆点:白色箭头),而在缺失突变体中(b)不存在(白色箭头)。c jou在核仁中表达(DAPI染色),但在突变体中(d)没有。e,在转基因全蝇(rescue-1和Del + rescue-1)上的jou的FISH。在result-1(野生型背景)(e)中,在肠上皮(红色点:白色箭头)和卵巢(ov)中看到jou表达,而在Del + rescue-1中表达仅限于肠道上皮细胞,在卵巢中不存在(ov)(f)。g,h ISH,用FITC标记的酪酰胺(绿色)显示,在野生型CS蝇的中肠(g)中,上皮细胞中可检测到jou。h在后肠中,jou不表达。i–k整个野生型CS蝇进行ISH。i jou与酪胺-Cy3同表达(白色箭头)。j DAPI染色标记核。k(i)的叠加图。J 仅显示jou在肠道上皮中的表达(白色箭头),而在神经系统中没有表达。

成年期的snoRNA:Ψ28S-1153延长了寿命

创制p[UAST-snoRNA-Ψ28S-1153](pUAS-jou8M)转基因品系。然后,将snoRNA表达专门靶向缺失背景中的肠上皮细胞,并通过ISH证实snoRNA确实在肠上皮细胞中正确表达。显示snoRNA-Ψ28S-1153在肠细胞中的特异性表达足以增加果蝇的寿命(图3a)。此外,要研究位于snoRNA:Ψ28S-1153上游的其他两个假定的snoRNA(snoRNA:2R:9445205和snoRNA:2R:9445410,分别简称为sno-2和sno-3)是否也参与了寿命确定,显示sno-2和sno-3在EC中的靶向表达并没有增加其寿命(图3b、c)。为了进一步支持该论证,还观察到与同基因对照果蝇相比长寿缺陷的挽救,用第2个Gal4驱动程序系Mex-Gal447表达snoRNA-Ψ28S-1153(UAS-jou8M)在肠的上皮中表达(图3d)。在缺失背景下,Mex-Gal4在肠道上皮细胞中的靶向表达也可以延长寿命。

其次,在缺失的遗传背景下,在孵化后立即开始饲喂RU486的果蝇,与没有饲喂RU486相比,成年期间的果蝇寿命增加(图3e)。相比之下,针对UAS-sno-2或UAS-sno-3的类似RU486诱导实验导致寿命减少(图3f、g),表明靶向表达这两个snoRNA可能是有害的,因此证实了jouvence是导致寿命延长的snoRNA。

图3 jou在肠细胞中的靶向表达足以挽救寿命。a snoRNA:Ψ28S-1153的靶向表达与对照组相比,在肠细胞中的靶向表达的寿命测试结果(生存曲线-累计下降)。肠上皮细胞中Del, Myo1A-Gal4> UAS-jou8M的表达足以延长寿命。b,c其他两种snoRNA的表达:sno-2(b)或sno-3(c)不会导致寿命的增加,甚至有害。d第二个肠道驱动细胞系Mex-Gal4(Del,Mex-Gal4> UAS-jou8M)也靶向肠上皮细胞的表达,足以延长寿命。e Mex-GS苍蝇(Del,Mex-GS> UAS-jou8M)仅在成年后喂入RU486触发snoRNA-jou的表达,与非喂养(non-诱导)同胞苍蝇相比寿命延长。 f,g仅在成年期饲喂RU486的Mex-GS苍蝇会触发sno-2(f)或sno-3(g)的表达,与未喂食(未诱导)的同胞相比,不增加而是减少寿命苍蝇。

为了确认snoRNA:Ψ28S-1153的表达水平并将其与寿命联系起来,研究者对切开的肠道进行了定量PCR,结果与预测一致。使用相同的驱动程序系将snoRNA:Ψ28S-1153过表达至内源性表达的13倍(Myo1A-Gal4)和28倍(Mex-Gal4)(图4f)。与它们的同基因对照果蝇相比,两种表达snoRNA显示出更长的寿命(图4a,b)。此外,与未诱导的果蝇(图4c)以及另一个独立的转基因品系相比,Mex-GS品系中通过RU486饲养的成虫特异性表达也增加了寿命(表达增加了30倍:图4g)。最后,与它们各自的同基因对照果蝇相比,Mex-GS对sno-2或sno-3诱导的成年期过表达没有改变寿命(图4d,e),这证实了snoRNA-jou对于确定寿命至关重要。总之, snoRNA:Ψ28S-1153在肠道上皮细胞中过表达时会延长寿命,可以将其视为长寿基因,因此将其命名为“jouvence”(jou)(意思是“青年”)。

图4肠细胞中jou的过表达增加了寿命。与野生型遗传背景相比,在野生型遗传背景下肠细胞中jou的靶向表达与寿命测试的结果(生存曲线-累计下降)。Myo1A-Gal4> UAS-jou8M(a)和Mex-Gal4> UAS-jou8M(b)在肠细胞中的过表达足以延长寿命。c仅在成年期过表达jou足以延长寿命(Mex-GS> UASjou8M只在成年期用RU486喂食的果蝇)。d,e仅在成年期过表达sno-2(d)或sno-3(e)对寿命没有任何影响(Mex-GS> UAS-sno-2或sno-3仅在成年期饲喂RU486 )。f,g snoRNA jouvence的表达水平,以rp49为内参。

过表达jouvence可以防止肠道增生

在老龄蝇中肠道上皮退化会导致肠道增生,因此比价了年轻(7天龄)和老龄(40天龄)果蝇中肠细胞的数量。与各自的WT相比,在jou缺失的果蝇中肠细胞增加了(图5a),表明其增生。有趣的是,在携带被基因组拯救的转基因蝇(Del; rescue-1)的老龄蝇(40天龄)以及携带肠道靶向表达的老龄蝇中未观察到肠细胞数量的增加。图5a显示尽管程度较小但过表达jouvence防止增生(Mex-Gal4> jou1M和Myo1A-Gal4> jou1M)。使用不同的方法标记了肠干细胞(ISC)以及ISC子细胞(成胚细胞:EBs)的数量和增殖,图5b显示,在缺失jouvence的果蝇中,标记的细胞数量增加了。为了评估ISC的增殖,计算了抗PH3阳性细胞的数量,显示与图5b非常相似的模式(图5c)。进一步使用了EdU标签标记分裂和复制细胞。图5d可以看到,在幼蝇中缺失jouvence,EdU标记的细胞数量增加了(与核内复制性EC的数量增加有关),而野生型WT老龄蝇EdU标记细胞的数量增加(图5b)。总而言之,这些结果表明,在缺失jouvence果蝇中观察到的EC数目增加是由于细胞的较高增殖所致。

jouvence调节肠上皮细胞的核内复制

首先,量化细胞核中DAPI染色荧光量反映DNA的数量。图5e显示与WT型对照相比,在缺失jouvence蝇中DNA的数量减少了,表明核内复制较少。有趣的是,在携带有基因组拯救的转基因的果蝇(Del + rescue-1)中以及过表达jouvence的缺失果蝇(Del,Mex-Gal4> UAS-jou8M)DNA的数量减少。进一步量化在WT遗传背景中过表达snoRNA-jouvence的果蝇中的核内复制,尤其是当仅使用成年基因表达系统在成年期表达时。喂食RU486以诱导其表达后,与未喂食的RU486对照相比,核内复制增加了(Mex-GS> jou1M),这表明jouvence在EC中参与了多倍体的控制。其次,通过RT-qPCR定量了已知参与核内复制周期的主要基因之一Cyclin-E(图5f)。在缺失jouvence果蝇中DAPI染色定量的DNA数量的减少,同时Cyclin-E RNA的表达降低,这一结果也得到了接下来的RNA-Seq分析结果的支持。因此,这些结果表明snoRNA-jouvence参与EC的核内复制。

图5. jouvence缺失增加了老果蝇的增生。 a年轻(7天龄:浅蓝色和深蓝色)和老龄(40天龄:浅红色和深红色)(浅= WT,深=缺失)的肠上皮细胞(ECs)数量。与年轻(7日龄)的果蝇相比,老龄WT果蝇的EC数量增加(增生)。但是,在jouvence缺失的果蝇中,这个数字会增加得更多(与浅蓝色和浅红色相比,深蓝色和深红色)。在WT遗传背景中过表达jou可防止增生(Myo1AGal4> UAS-jou1M和Mex-Gal4> UAS-jou1M)。b在WT对照和jouvence缺失果蝇中D1 +细胞的数目(D1-Gal4> UAS-GFP-nls)。c抗PH3细胞的数量。d幼蝇(蓝色)和苍蝇(红色)中被EdU标记的细胞数量。e用于评估核内复制的DAPI荧光的相对强度。

jouvence在体内的表达(northern blot)

通过Northern blot进一步验证jouvence的表达。图6以在对照WT、携带有基因组拯救的转基因(Del + rescue-1)以及肠道中jouvence的靶向表达(Del,Myo1A-Gal4> jou8M和Del,Mex-Gal4> jou8M)果蝇检测到约150个核苷酸的条带与预期的jouvence大小相对应。snoRNA-jouvence伪尿苷化rRNA。根据已报道的主要注释snoRNA:Ψ28S-1153的生物信息学研究,预计snoRNAjouvence(snoRNA:Ψ28S-1153)将在位置1153催化28S-rRNA碱基的修饰。进一步检查从肠中提取的rRNA是否确实被伪尿嘧啶化。如图6b所示正如所预期的,在WT-Control果蝇中28S-rRNA的1153位处被伪尿嘧啶化,而在缺失jouvence果蝇中未被伪尿苷化,这表明该位点特异性伪尿素化需要jou。在携带已被基因组拯救的转基因的Jou缺失果蝇(Del + Surve-1)中以及在肠道中具有特异靶向表达Jouvence的果蝇中(Del,Myo1A-Gal4> jou8M和Del, Mex-Gal4> jou8M)证明了伪尿嘧啶化机制恢复。此外,在野生型对照果蝇中18S-rRNAd的1425位的伪尿嘧啶化,由于缺失jouvence导致其消失(图6c),而在基因组拯救的果蝇(Del + rescue-1和Del + rescue-2)和肠道特异性靶向表达(Del,Mex-Gal4> jou8M)中被恢复。

图6. Jouvence体内过程及参与了伪尿嘧啶化。 Northern blot显示在野生型对照果蝇中的jouvence(148个核苷酸),在缺失Jouvence后缺失,并在基因组拯救的果蝇(Del; rescue-1)和肠靶向(Myo1A-Gal4> jou8M和Mex-Gal4> jou8M)中得以拯救。b snoRNA-jouvence伪尿嘧啶化WT对照中1153位置的28S-rRNA,但在缺失Jouvence后缺失,并在基因组拯救的果蝇(Del; rescued-1)以及肠道靶向(Myo1A-Gal4> jou8M和Mex-Gal4> jou8M)中恢复。在18S-rRNA 的1425位发生伪尿嘧啶化相同。

缺失jouvence的果蝇中的部分基因失调

利用转录组分析WT野生型和Jou缺失的果蝇肠道组织,显示314个基因被上调,319个基因被下调(图7a、b)。KEGG分析显示,有20条途径在统计学上被上调(图7c),最主要的是代谢途径,包括55个差异基因,而只有6条途径被下调(图7d),被最下调的途径是谷胱甘肽代谢途径。此外,GO分析显示,大多数失调的基因都具有催化活性。

为了验证RNA-Seq结果,选择了差异变化程度最高的基因对肠道组织进行RT-qPCR。图8显示GstE5(谷胱甘肽S转移酶E5),Gba1a(葡萄糖脑苷脂酶1a)、LysB(溶菌酶B)和ninaD上调,而CG6296(脂肪酶和磷脂酰胆碱1-酰基水解酶)、Cyp4p2(细胞色素P450-4p2)下调,证实了RNA-Seq的结果。通过对rescue基因型的分析证实了jou调控这些基因。以上结果表明,snoRNA-jou的长寿功能取决于其调节mRNA水平或核糖体RNA稳定性,甚至可能调节肠上皮细胞基因表达的能力。但是,这种精确的机制仍有待进一步研究。

图7 RNA-Seq分析显示数百个基因失调。对来自肠道的总RNA进行的转录组分析(RNA-Seq)显示,与对照组相比,缺失jouvence导致314个基因上调,319个下调。b差异表达基因的聚类分析(热图)。c,d根据KEGG分析58对失调基因的途径富集的统计数据。简而言之,对于上调的基因(c),代谢途径是主要的失控途径,而对于下调的基因(d),谷胱甘肽代谢是主要的失调途径。
图8 RT-qPCR验证基因在缺失jouvence后失调。缺失jouvence导致GstE5、Gba1a、LysB和ninaD基因的mRNA水平升高,而CG6296和Cyp4p2则mRNA水平降低。

过表达jouvence仅使少数基因失调

使用Gene-Switch系统(Mex-GS> jou8M)对仅在成年后才表达条件性成年蝇的肠进行了RNA-Seq,将RU486喂养的蝇(诱导表达)与没有RU486喂养的蝇(控制非诱导)进行了比较。出乎意料的是,结果显示jouvence过表达果蝇中只有9个基因被解除调控(图9)。KEGG分析显示,它们主要参与剪接体和长寿调节途径,其中表达最上调的是Hsp70Bb基因(Heat-shockprotein-70Bb)。

图9在过表达jou的果蝇中只有很少的基因被解除调控。a对过表达果蝇的蝇肠(Mex-GS> jou8M)肠道中的总RNA进行的转录组分析(RNA-Seq),与未诱导的蝇相比,RU486喂养仅上调了9个基因,而没有基因被下调。b差异表达基因的聚类分析(热图)。c根据KEGG分析58对失调基因的途径富集统计。

恢复ninaD或CG6296的mRNA水平可以挽救生命。

首先,选择由RNA-Seq中最上调的基因之一ninaD,RNAi降低和恢复其mRNA水平。ninaD-RNAi的靶向表达,特别是在肠道中,更确切地说,仅在成年期就足以降低和恢复mRNA水平(图8 g-插图),从而延长寿命(图8g)。相反对于下调最多的基因之一CG6296,为了恢复其转录水平,构建了UAS-cDNA和转基因蝇系。CG6296 cDNA的靶向表达,特别是在肠道中和仅在成年后才恢复mRNA水平(图8h-插图),并且还会大大延长寿命。这些结果突出了snoRNA对核糖体RNA的作用、一些下游失控的基因与寿命之间的遗传和分子联系。同时研究转基因品系对干燥和饥饿的抵抗力,发现jouvence对压力的有害作用具有保护作用。

snoRNA jouvence通过进化得以保留

使用BLAST和三级结构基序搜索进行的生物信息学分析揭示了果蝇中的12种jou同源物、小鼠中的2种同源物和人中的1种同源物(图10),表明该特定snoRNA的进化正压力。在小鼠中,假定snoRNA jouvence位于15号染色体位置:30336889–30337017和位于18号染色体位置:6495012–6495133。人类独特的假定snoRNA jouvence位于11号染色体位置:12822722–12822880。

为了进一步探索snoRNA优势在哺乳动物中的推定作用,我们通过RT-PCR评估了人类和小鼠各种组织中的表达。在人类中,在肠道、大脑中检测到独特的假定snoRNA jou同源物,在卵巢和肾脏中检测到信号较弱。在小鼠大脑中检测到snoRNA-15,但在卵巢、肾脏和肠中未检测到,而在小鼠脑、卵巢中检测到snoRNA-18,但在肾脏中未检测到。

图10 jou在整个进化过程中都是保守的。a 果蝇jou snoRNA的RNA序列。b FlyBase上有12种果蝇物种的jou序列同源性。c,d小鼠基因组中jou的直系同源序列。检测到两个jou副本,分别位于15号和18号染色体上。e在人类基因组中的同源序列。仅鉴定出一个拷贝,位于11号染色体上。

讨论

本研究报告一个被命名为jouvence(jou)的snoRNA(snoRNA:Ψ28S-1153)的鉴定和分子表征,其缺失会降低寿命,反之过表达则会使其寿命增加。通过一系列遗传试验,证明jouvence在肠胃上皮中起作用以促进寿命,而与另外两个位置的snoRNA无关。在果蝇中,寿命和肠道之间的关系已有报道。在老龄野生型果蝇中,ISC过度增殖会导致ISC子代细胞错误分化,从而导致肠道增生:“过度增殖性疾病”。有趣的是,在肠道上皮细胞中保留过度增殖可以延长寿命。在缺失jouvence果蝇中老龄和年轻之间增生程度更高。进一步标记也证实发现与对照WT相比,缺失jouvence果蝇中ISC的数量增加,以及分裂细胞的数量(抗PH3和EdU)增加。综合考虑,表明缺失jouvence果蝇中的增殖稳态的破坏更高。更惊人的是,在缺失系或野生型遗传背景中过表达jou可防止老龄果蝇的增生。最近,在秀丽隐杆线虫研究中发现核仁大小和寿命之间的联系,是一种与核仁蛋白原纤维蛋白有关的机制。原纤维蛋白与C/D box的snoRNA相关,而snoRNA jouvence属于H/ACA box,不涉及原纤维蛋白。本研究扩展了这些发现,进一步确认核仁与长寿有关。

许多寿命基因显示出可以改变对压力的抵抗力。有趣的是,jou功能的丧失降低了对干燥的抵抗力,而相反,回复或过表达jou增加了对该压力的抵抗力,可能是由于对过表达的RNA-Seq揭示的Hsp78Bb基因表达水平的提高有关,这一假说尚待检验。但是每种压力结果不尽相同,可能是依赖于特定的生理和/或代谢参数,不同压力参数不同。

RNA-Seq和RT-qPCR分析揭示了部分基因的上调或下调。有趣的是,长寿最典型的途径包括胰岛素信号通路(InR、chico、FOXO、dILP3)在缺失jouvence果蝇中被下调,而dILP4则被上调。RNA-Seq揭示的第2个惊人发现与报道的秀丽隐杆线虫、果蝇和小鼠中Myc/核糖体生物发生与寿命之间的联系有关。

实际上,据报道几种snoRNA是Myc的靶标。然而,对Myc靶基因研究中未鉴定到snoRNA jouvence。这一事实得到了以下事实的佐证,即在jouvence基因附近和Myc基因附近未发现任何Myc共有E-box序列(CACGTG)并且核糖体的生物发生途径在缺失jouvence果蝇中不受影响。因此,这种独立于Jou的Myc调节反而导致这样的假设,即jouvence可能通过假尿苷化作用核糖体的稳定性和/或优化了核糖体的功能,而不是直接作用于核糖体的合成。另外,对于某些差异基因(GstE5、Gba1a和LysB),jou显然是导致这种失调的snoRNA。但是,对于其他一些基因(ninaD、CG6296和Cyp4p2),调控机制似乎更加复杂,要么需要非常精确的snoRNA-jou水平,要么可能涉及其他两个假定的snoRNA。为了确定并确认snoRNA jouvence、失调的基因和长寿表型之间的联系,验证了其中的两个基因(ninaD和CG6296),发现对于确定寿命都至关重要(图8)。但是,Gba1a基因表达的恢复无法恢复果蝇的寿命。有趣的是,这两个基因与脂质和/或胆固醇代谢有关。实际上,ninaD编码与哺乳动物B类I型清道夫受体SR-BI同源的膜蛋白。在哺乳动物中,SR-BI在胆固醇和高密度脂蛋白(HDL)代谢以及维持血浆胆固醇水平中起着关键作用。CG6296(一个尚未明确表征的基因)具有类似于三酰甘油脂肪酶家族的蛋白质结构域,具有预测的脂肪酶活性和磷脂酰胆碱1-酰基水解酶活性,提示其在脂质代谢中起作用。

综上,这些结果表明snoRNA jouvence涉及许多mRNA水平的微调。研究已经证明,jouvence伪尿嘧啶化28S-rRNA和18S-rRNA。因此,snoRNAjouvence可能在rRNA的成熟和/或稳定中起作用,其他调控影响现阶段尚不能确认。例如,将需要进一步的实验来确定核糖体的3D结构构象(假尿嘧啶化或非假尿酸化),以回答这个精确的问题。最后,尽管人们普遍认为snoRNA可能主要是所有细胞中普遍存在的持家机制,但本研究结果却主张在某些组织存在特定的snoRNA机制,例如在这里为肠的上皮中。

根据其主要序列,jou属于H/ACA snoRNA22。有趣的是在人类中某些病理已与其分类的snoRNA相关。例如,端粒酶(RNP逆转录酶)的snoRNA的H/ACA box发生突变会产生多效性遗传疾病。因此,推测哺乳动物的jouvence直系同源物可以在小鼠和人类中发挥重要作用,但仍有待研究。

评论

本文描述了一个小的核仁RNA(snoRNA:Ψ28S-1153),由于其与寿命相关,缺失会降低寿命,因此将其命名为jouvence(jou)即为青春。jou在肠上皮细胞中表达。其缺失可导致肠道增生,靶向表达可防止增生、挽救并显着延长寿命。由于snoRNA非常保守,在小鼠和人类中都鉴定出直系同源物。可以看出jou是研究肠道、衰老和寿命之间关系的理想候选对象。由于果蝇和哺乳动物的肠道细胞在细胞和分子水平上都非常相似,而snoRNA在整个进化过程中都非常保守,可以假设哺乳动物也存在这样的机制。因此,snoRNA jouvence可能改善健康衰老的有前途的治疗候选物。


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