科研 | 多环芳烃污染对土壤微生物多样性及共代谢途径的影响
本文由黄朝编译，董小橙、江舜尧编辑。
原创微文，欢迎转发转载。
在本研究中，我们使用分类学和功能宏基因组学方法分析了在 PAH（多环芳烃）污染的土壤的生物修复过程中，天然微生物群落与先前构建的PAH降解微生物复合物之间产生的一些影响（例如置换，持久性，消失）。使用玉米秸秆作为添加剂的真菌-细菌复合物的生物强化和天然微生物群落的生物刺激导致污染土壤的微生物多样性的显着变化，使天然微生物群落转变为有利于降解的特定种群。功能宏基因组学显示了基因丰度的变化，表明其偏向于芳香烃和中间降解途径，这极大地减少了PAH矿化。另一方面，发现有利于形成有毒中间体的途径，例如细胞色素P450介导的反应，在生物强化的土壤中显着减少。使用微生物复合物在土壤中的PAH生物降解速度更快，并且与其他混合微生物复合物相比，由于共代谢降解增加，从而达到更高的降解值（30天后为84％）。观察到接种的和未接种的土壤之间的主要区别是芳香环羟基化双加氧酶，漆酶，原儿茶酸，水杨酸盐和苯甲酸脱氢酶基因。根据我们的研究结果，我们提出在PAH降解过程中土壤中会出现几种并发的代谢途径。
论文ID
原名：Comparative metagenomic analysis of PAH degradation in soil by amixed microbial consortium
译名：微生物菌群混合物对土壤中PAH降解的宏观成分分析
期刊：Journal of Hazardous Materials
IF：6.43
发表时间：2016年
通信作者：Angel E. Absalóna和Diana V. Cortés-Espinosaa
通信作者单位：墨西哥桑坦德大学，物理和自然科学学院
实验设计
实验设计图
实验内容
1 土壤微生物的异养活性
接种了多环芳烃降解菌复合物C1的土壤微生态系统组成表明，到第2天，二氧化碳生产的最快，生物刺激下的二氧化碳生产略有下降。接种微生物在前两周产生的二氧化碳比仅生物刺激的控制处理的多，但是从第16天开始恢复下降趋势，同时受到生物刺激的微生态系统观察到更高的瞬时二氧化碳产生，即使在第30天二者累积的二氧化碳水平几乎相同（图1）。一般而言，与微生态系统中类似混合菌群的产生的二氧化碳水平相比，通过土壤中的生物降解过程产生的二氧化碳更高，其中最大累积产量在60天生长后达到1毫克/（初始干物质）。正如预期的那样，接种的土壤促进了呼吸水平的增加，特别是考虑到土壤中掺入高浓度多环芳烃会对土壤种群的数量和多样性造成极大影响，这可以解释前两周观察到的二氧化碳生产的差异。无论土壤的接种如何，玉米秸秆的生物刺激促进了污染土壤中CO2浓度的增加。
图1. 具有接种土壤（用降解菌聚合物C1 /生物刺激）和未接种土壤（仅生物刺激）的微生态系统的异养活性（积累的CO2和瞬时的CO2）
2 土壤中多环芳烃的降解
我们的结果表明，在第16天和第30天，接种了多环芳烃降解菌复合物C1的土壤中的菲，芘和苯并芘降解明显高于仅受生物刺激的对照组。如图2所示，菲在前16天内比芘和苯并芘以较高的速率降解（分别为58.12％，36.64％和27.16％），但有趣的是芘，尤其是苯并芘，在第16天乃至第16天后以较高的速率降解。30后分别达到59.66％和58.98％。这些结果与我们之前的报告一致，使用了类似的天然降解微生物，其中无菌土壤中高分子量多环芳烃降解在初始阶段相对较低，但在后期阶段显着增加。实际上，响应低分子量多环芳烃降解途径的诱导，可以实现在低分子量多环芳烃的混合物中高分子量多环芳烃如芘和苯并芘的增加的代谢降解途径。与土壤中其他混合微生物复合物相比，使用多环芳烃降解菌复合物C1的多环芳烃的生物降解也显示出较高的降解值。对于菲来说，这一点更为明显，即使高分子量多环芳烃降解也高于之前的报道，第30天降解率达到84.29％。即使本研究中土壤使用的多环芳烃浓度至少比那些降低了5倍。在先前的研究中，使用土壤中的混合微生物复合物，低分子量和高分子量多环芳烃的降解速度几乎一样快。尽管微生物生长速率不一定与污染物降解程度有关，有效的多环芳烃生物的降解的较高生长率提示它们被微生物种群用作碳源，如存在或不存在多环芳烃的情况下，生物刺激的控制产生的CO2的差异可以证明（图1）。此外，微生物生长速率的降低可以表明微生物达到稳定期和次级代谢期，产生可以影响多环芳烃氧化的烃降解酶。仅添加玉米秸秆的对照组，到第30天，菲（11.73％），芘（10.00％）和苯并芘P（2.67％）（大约相当于多环芳烃总混合物降解的6％）的降解率显着降低。接种多环芳烃降解菌复合物C1的土壤，其降解率高于多环芳烃初始混合物的65％。实际上，由于在第0天存在培养基和玉米秸秆而引起的生长依赖性PAH降解，大多数降解发生在该过程的第一阶段期间。
图2. 通过降解菌聚合物C1接种和仅生物刺激的土壤微生态系统的PAH降解，其中非无菌土壤掺入2500mg / kg的菲，芘和苯并芘。
3 土壤生物修复的分类学分析
基于来自土壤微生态系统的完整测序基因组的不同分类群的组成，显示细菌的总体占优势，而真核生物和古细菌生物的相对比例较小，无论其处理或采样日如何（图3A）。在整个生物修复过程中，古菌群落保持稳定，除了第30天的对照组微生态系统以外，在群落组成方面仅略有差异（图3B）。相比之下，用我们的微生物菌群接种土壤会导致细菌种群发生明显的变化。例如，用多环芳烃降解菌复合物C1处理后，随着时间的推移，厚壁菌门，放线菌和拟杆菌的产生显着增加，从而损害变形菌（图3C）。然而，接种的微生态系统中变形细菌的相对比例明显高于仅生物刺激的对照组，对于厚壁菌门观察到相反的情况是因为对照组的微生态系统包含比接种系统更高比例的该分类群。由于微生物菌群含有厚壁菌门和变形杆菌（肺炎克雷伯菌H1，铜绿假单胞菌H6，克雷伯氏菌属H10和嗜麦芽窄食单胞菌B14）成员，这种移位可以表明变形菌的更好适应性和对其他群落的积极影响，特别是在拟杆菌/氯代组中，其在对照组微生态系统中的比例较低。在细菌内，α和γ变形菌占据比例更高（图3D），两者都含有多环芳烃降解物的已知物种，以及放线菌种群。先前在含有重质原油污染土壤的微生态系统中已经报道了类似的结果，其中γ-变形菌的成员最初在污染的微生态系统中占主导地位，但是90天的孵化后被厚壁菌门和α变形菌取代。随着时间的推移，真菌种群保持相对稳定，子囊菌是最大的分类群，其中较小比例的序列属于担子菌和未知的（图3E）。在子囊菌门中，子囊菌亚门是最突出的组（图3F）。这并不出乎意料，因为除了变异藻类H9之外，子囊菌亚门包含降解复合物中包含的所有真菌菌株。宏基因组的α多样性测量（香农多样性指数）显示，在土壤中添加多环芳烃降解菌复合物C1有助于物种丰富度随时间的整体增加，从第0天的45.1变为第16天的67.7和第30天的421.1。我们假设这可能是土壤毒性降低的结果，因为土壤中PAHs的消失导致土壤中的微生物多样性随着PAH浓度的降低而增加。此外，包含降解复合物的细菌和真菌物种的种群动态显示出随时间的重要变化，与对照组微生态系统相比表现出显着差异。发现嗜麦芽寡养单胞菌在接种的微生态系统中是最显着的细菌，伴随PAH降解，其相对比例持续增加，而克雷伯氏菌随着时间的推移呈现出减少的趋势（图3G）。在真菌物种中观察到类似的模式，其中黄曲霉主要在接种有降解菌复合物C1和木霉属的土壤中占主导地位，并且曲霉属的比例随时间增加（图3H）。在第16天后，根瘤菌种群未检测到，表明对土壤的适应性差，并且可能是其他微生物的置换。这与之前的研究报告一致，即几种根瘤菌物种对PAHs的耐受性差，即使它们被证明可以去除少量的多环芳烃。除了根瘤菌之外，在对照组微生态系统中，包含降解复合物的微生物物种在时间上保持相对稳定，具有较高比例的是蜡状芽孢杆菌，肺炎克雷伯氏菌和黄曲霉。
图3. 基于土壤微生态系统的全序列数据集的不同分类群的组成。（一）域名级别; （B）古菌门级; （c）细菌门级; （d）变形菌门和放线菌; （E）真菌门; （F）子囊菌亚门; （G）和（H），降解联合体中包括的细菌和真菌分类群。
4 多环芳烃生物修复的功能和代谢分析
SEED功能子系统注释显示了属于土壤中代谢途径的基因的优势，特别是碳水化合物，氨基酸和能量代谢（图4A）。尽管土壤中芳香族降解途径在SEED 1级没有显示明显的差异，但是芳香化合物降解途径的更深层次的显示，接种和未接种土壤中芳香族降解基因的外围途径占主导地位，而中心途径芳香中间体的代谢也发现在相对较高的水平（图4B）。有趣的是，在仅受生物刺激的对照组中，芳香厌氧降解途径的基因丰度较高，尽管没有显着差异。由于所有处理都使用玉米秸秆作为添加剂，这种差异可以直接归因于降解复合物的存在，这可能会导致接种土壤中更高比例的降解基因。
图4. SEED子系统在生物修复处理期间来自接种和未接种的宏观微生态系统基因因组的功能热图。A）1级子系统的差异; B）与芳香族化合物代谢相关的子系统的差异。
尽管我们的方法仅限于分析在宏基因组的潜在功能基因，我们观察到了几个基因的丰度，降解菌复合物C1的存在和污染土壤中PAHs的高度降解之间的关系。这些结果与最近的研究一致，也显示了土壤中PAHs的存在与PAH代谢中涉及的几种氧化还原酶的高基因丰度之间的关系，作为天然或引入的土壤微生物对PAH降解潜力的反映。例如，已发现芳香环羟基化双加氧酶家族基因在受PAH污染的土壤和沉积物中比在未污染的土壤中更丰富; Meier 还通过底物诱导的基因表达方法报道了PAH污染土壤中水杨酸加氧酶家族基因的丰富程度。我们的研究结果表明，接种土壤促进了苯甲酸盐降解和代谢，原儿茶酸降解和氯代芳族化合物降解所涉及的基因丰度的显着增加，以及龙胆酸盐降解，水杨酸盐和龙胆酸分解代谢基因丰度的非显着增加（图5）。已经发现酶编码基因的类似物在芳香族化合物的降解中起重要作用，产生关键的代谢中间体，包括水杨酸盐，3-氯苯甲酸盐和对苯二酚，它们作为PAH降解酶的强诱导剂。经过充分研究的分子是水杨酸盐，它可以诱导细菌中的萘二加氧酶，并且还可以通过细菌刺激高分子量多环芳烃的降解。观察到的基因丰度的差异表明有氧路径的总体增加– 即参与可以进入三羧酸循环的产物中的芳族化合物的降解，这可能非常有利于PAH的矿化。当需氧特异性环羟基化裂解酶如萘1,2-双加氧酶，外二醇双加氧酶，环羟基化双加氧酶，苯甲酸盐/甲苯磺酸-1,2双加氧酶，儿茶酚1,2-双加氧酶，儿茶酚2,3-双加氧酶，原儿茶酶时，也证实了这一点。与仅生物刺激的对照组相比，发现4-双加氧酶，原儿茶酸4,5-双加氧酶和1,2-二羟基萘双加氧酶在接种的微生态系统中具有显着更高的水平（p = 0.0001）（图6）。在用柴油和原油污染的土壤和沉积物的生物修复的宏基因组分析中也发现了这种酶的水平升高。尽管这些酶主要在细菌中被描述，但是一些非木质素降解的真菌物种也可能产生参与PAH降解的间位和邻位裂解双加氧酶。此外，还发现在接种的土壤中漆酶基因丰度显着增加，表明真核生物参与了PAH降解的初始氧化和中间步骤。在一个特殊情况下，发现木霉H15在PAHs存在的情况下产生环裂解双加氧酶和漆酶。我们的研究结果表明，随着木霉H15在接种土壤中的存活和持久性，伴随着更高的漆酶基因丰度（图3H）。值得注意的是，当微生物复合物接种到土壤中时，发现细胞色素P450单加氧酶参与PAH代谢的细菌和真核基因的丰度显着降低（图6）。这表明PAH矿化途径，可能偏向减少死亡代谢物，有毒中间体（例如反式二氢二醇）和共轭物（例如邻葡萄糖醛酸苷，邻葡糖苷和甲氧基分子）的形成，其形成哺乳动物的DNA复合物和随后的致癌作用。
图5. 来自属于芳香族化合物子系统代谢的土壤宏基因组的基因的SEED扩展误差条图。使用双侧Welch's t检验进行成对比较。
图6. 来自土壤宏基因组的基因的扩展误差条图，其中双侧Welchis t检验产生p值≤0.05。显示的所有基因都限于芳香族和中间降解子系统。
我们从功能分析中发现了接种土壤中几种伴随的降解途径的证据，证明了菲，芘和苯并芘的降解（图7）。初始氧化步骤由漆酶和环羟基化双加氧酶驱动，而后续步骤涉及双加氧酶和脱羧酶的作用，通过中心代谢途径促进PAHs的进一步降解。有趣的是，在接种的土壤中发现了几种广泛特异性酶编码基因的比例，例如萘1,2-双加氧酶（EC 1.14.12.12），具有广泛的底物特异性，最终允许其他几种芳香化合物的顺式- 羟基化，包括高分子量-PAHs。我们的结果表明，相同的酶，以及类似的细菌环裂解二氧基- 氨基酶在这里称为顺式-PAH双加氧酶（EC 1.14.12.）在接种土壤的菲，芘和苯并芘降解的初始和中间步骤中起重要作用。假设接种的土壤和天然土壤微生物能够使用广泛的特异性酶和共同途径来代谢多种多环芳烃，单一多环芳烃降解的诱导剂最终可以共同刺激多种多环芳烃的降解，正如已经报道的那样。
图 7
结 论
我们的结果证明了混合微生物复合物大量降低土壤中PAHs的效率，这可能是由于共代谢降解增加所致。宏基因组分析表明，接种PAH降解的混合物会对PAH污染的土壤的微生物多样性产生明显的变化，使天然微生物群落转变为降解特定种群。功能宏基因组显示基因丰度的变化表明偏向于芳香烃和中间降解途径，极大地有利于PAH矿化，从我们的宏基因组分析中获得的信息为接种到土壤中的PAH降解微生物的代谢潜力提供了新的见解，并提出了几种可能的代谢途径，这些途径可能在受低分子量和高分子量PAHs污染的土壤中的降解过程中同时发生。
评 论
土壤中包含多种多样的微生物类群，为适应多环芳烃污染环境，许多能降解多环芳烃的微生物会自然富集。在研究中，作者利用高通量测序技术探索污染土壤中微生物群落结构，分析生物刺激和生物强化对微生物组成的影响。揭示多环芳烃污染土壤微生物的生物多样性，为生态系统修复和环境治理提供有价值的线索。
你可能还喜欢
（1）科研 | Nature子刊：根系分泌的代谢物通过塑造根际微生物群来驱动植物-土壤对生长和防御的反馈
（2）科研 | ISME：氮沉降对全球土壤微生物的负效应 (国人作品)
（3）科研 | ISME：升温改变功能性微生物群落增强有机碳分解（国人作品）
（4）科研 | Nature：地球表层土壤微生物群落的结构和功能
（5）科研 | ISME：空间结构对土壤微生物间一种新型营养缺陷相互作用的影响
（6）综述|Nature review microbiology：多年冻土的微生物生态学
（7）科研 | 猪粪与棉秆共堆肥过程中微生物群落和环境变量对抗生素抗性基因的贡献（国人作品）
培训班推荐👇，快来参加，充实自己吧！