科研│Rice：利用QTL测序和转录组测序联合分析水稻芽期耐盐性主效QTL及候选基因（国人佳作）
编译：秦时明月，编辑：景行、江舜尧。
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盐胁迫是限制全球水稻生产的主要非生物胁迫之一。直播栽培模式下，水稻芽期耐盐性直接影响秧苗成活率和最终产量。然而，有关芽期耐盐性的数量性状位点(QTL)定位和图位克隆的报道还很有限。本研究以水稻品种IR36(盐敏感)和卫国(耐盐)杂交F2：3群体的40个极端耐盐个体和40个极端盐敏感个体，利用基于全基因组测序的QTL-seq，确定了芽期耐盐QTL区间。利用SNP-Index和ED算法在7号染色体上检测到一个与相对枝长相关的主效QTL qRSL7。根据亲本间的单核苷酸多态性(SNPs)，在qRSL7附近开发了25个KASP标记，并对F2：3群体中的199个个体进行了区域QTL定位。研究人员将其缩小到222kb的基因组区间。另外，对IR36和卫国在盐胁迫后36h和萌芽期对照材料进行RNA测序，在候选区域检测到5个差异表达基因(DEG)。qRT-PCR结果显示与RNA-seq数据相同的表达模式。序列分析表明，IR36与卫国的Os07g0569700 (OsSAP16)序列存在1bp的Indel差异。OsSAP16编码一种胁迫相关蛋白，在干旱胁迫下表达增强。因此，OsSAP16是qRSL7的候选基因。本研究结果为qRSL7基因的克隆和利用分子标记辅助选择(MAS)提高水稻品种耐盐性奠定了基础。
论文ID
原名：Identification of a Major QTL and Candidate Gene Analysis of Salt Tolerance at the Bud Burst Stage in Rice (Oryza sativa L.) Using QTL-Seq and RNA-Seq
译名：利用QTL测序和转录组测序鉴定水稻芽期耐盐性主效QTL及候选基因
期刊：Rice
IF：3.912
发表时间：2020年8月
通讯作者：邹德堂
通讯作者单位：东北农业大学
DOI号：10.1186/s12284-020-00416-1
实验设计
结果
1 两个混池指标的筛选与评价
本研究利用IR36与卫国杂交，构建了一个包含983个QTL-seq分析系的F2：3群体。对983个单株在萌芽期盐胁迫和对照条件下的地上部长度(SL)、根数(RN)、根长(RL)及其相对值进行了测定。只有相对地上部长度(RSL)呈正态分布，而相对根数(RRN)和相对根长(RRL)呈偏态分布(图1A)，这与数量性状的遗传不一致。超过200个个体的RRN和RRL值均为0(图1A)，这是由于盐胁迫后大多数品系的根系生长缓慢或停止所致。因此，以RSL作为两个混合池的筛选性状，筛选出40个极端耐盐性品系和40个极端盐敏性品系，分别制备耐盐池(T-POOL)和敏感池(S-POOL)，并进行DNA测序。S池的RSL显著低于T池，表明S池的整体表型数据受盐胁迫的影响很大(图1B)。此外，植物在NaCl盐胁迫下存活的关键是维持细胞内低Na+/K+比值。为了验证为T池和S池选择的极值线的准确性，研究人员测定了地上部的Na+/K+比率(SNK)，发现T池的SNK低于S池。此外，RRN和RRL的表型统计也证明了这两个池极端系选择的正确性(图1B)。图2显示了盐处理后双亲的表型，图3显示了从盐处理后的T池和S池中随机选择的5个F2：3植株的表型。
图2. 卫国和IR36在0.5%NaCl处理10天后的表型。
图3. A 在0.5%NaCl处理10天后，从T池中随机选取5个F2：3植株进行表型分析。B 从S池中随机选择的5株F2：3植株在0.5% NaCl处理10天后的表型。
2 双亲和极端池的排序
从两个亲本和两个F2池中获得了141Gbp的clean reads，Q30都达到了85%。平均测序深度为27.60X，平均作图比为98.95%，平均基因组覆盖率为96.21%。采用GATK软件对结果中的SNP进行分析。根据亲本和两个F2池与日本晴参考基因组比较获得的SNPs，在IR36和卫国之间共检测到4825004个，其中包括6395个非编码转录本变体。此外，在T-POOL和S-POOL之间检测到1,085,342个SNP，其中包含1740个非编码转录本SNP。使用在T-POOL和S-POOL之间检测到的SNP进行关联分析。
3 结合SNP-Index算法和ED算法的QTL-Seq分析
研究人员使用两种算法在芽期检测与耐盐性相关的QTL。如图4和表1所示，SNP-Index共检测到3个区域，分别位于第1、1和7号染色体上，其大小分别为2.68Mb、2.92Mb和4.17Mb。ED共检测到两个区域，均位于7号染色体上，物理距离分别为5.17Mb和14.13Mb(图5，表1)。考虑到重叠区域，这两种方法在7号染色体上得到了一个20,160,000-24,330,000 bp的区域，命名为qRSL7，该区域被认为是与水稻芽期耐盐性相关的候选区域(表1)。通过对该区间的基因序列分析，共发现16415个SNPs和2719个Indels，其中引起氨基酸变化的SNPs和Indels分别为554个和50个。在4.17Mb区域内，基于RAP-DB数据库预测了532个基因。
图5.ED算法定位耐盐QTL。
表1. 用SNP-Index和ED算法检测染色体耐盐区域的分布。
4 区域连锁图谱分析
由于qRSL7仍然含有大量的基因，研究人员在该区域附近开发了25个KASP标记，并利用它们对从983个F2：3群体中随机选择的199个F2：3品系进行了基因分型。在盐胁迫和对照条件下，统计亲本和199个F2：3品系的SL及其相对值。盐胁迫和对照条件下的SL表型值和RSL在亲本间均存在显著差异，199个F2：3系在对照和盐胁迫下呈连续分布(图6)。亲本的表型值介于199个F2：3个体的极值之间，表现为超亲分离(图6)。偏度和峰度的绝对值均小于1，表明RSL数据适合QTL分析。
经ICIMapping4.2软件计算，7号染色体上的连锁区间为222kb (图7)。如表2所示，RSL与SNP13-SNP14标记区间连锁。qRSL7可以解释24.90%的表型变异，其LOD值和加性效应分别为11.84和−0.12。QTL的正等位基因由卫国贡献(表2)。因此，通过构建遗传图谱，qRSL7的区间从4.17Mb优化到222kb，该区域包含27个基因。
5 RNA-Seq
为了鉴定亲本之间的差异，研究人员在盐胁迫后36h对IR36和卫国进行了转录组分析。在正常(IR和WG)和盐处理(TIR和TWG)条件下，IR36和卫国转录组文库分别获得2377万、2395万、2370万和2417万个clean reads。每个样品的优质碱基(%≥Q30)均大于88.88%。比对结果表明，所有12个样本中75.82-82.38%的clean reads可以定位到参考基因组。IR36和卫国大约34.45(72.57%)和3749万(77.92%)个reads可以分别唯一地映射到参考基因组。
6 DEGs的分类
通过对同一水稻品种在不同条件(对照和胁迫)下和同一条件下不同品种(IR36和卫国)的样品进行比较，建立了TWG与TIR、WG与IR、IR与TIR、WG与TWG的4个比较组。当阈值FDR<0.05时，TWG与TIR、WG与IR、IR与TIR、WG与TWG的显著差异的DEG数量分别为3227、4177、5921和1519。结果表明，不同品种和不同处理间的基因表达水平存在显著差异。在不同品种的两个对照组中，TWG与TIR的3227个DEG中有1150个DEGs表达上调，2077个DEGs表达下调，WG与IR的4177个DEGs中分别有1220个和2957个DEGs表达上调和下调。此外，IR与TIR相比，3984个DEGs上调，1937个DEGs下调，而WG与TWG相比，1237个DEGs上调，282个DEGs下调。显然，与TIR相比，IR中更多的DEG表达上调。此外，在盐分条件下，与耐盐品种相比，盐敏感品种对盐胁迫的反应比耐盐品种更多。这说明盐胁迫对盐敏感品种的影响大于对耐盐品种的影响。总体而言，在所有四组中都检测到了特异的DEG。这些DEG可分为15个互不相交的亚组，其中TWG与TIR、WG与IR、IR与TWG的组特异性DEG分别为6.19%(601/9708)、10.88%(1056/9708)、34.06%(3307/9708)和2.79%(271/9708)。
7 GO与KEGG富集分析
在四个对照组中，TWG与TIR、WG与IR、IR与TIR、WG与TWG分别有2383 (73.85%)、3119 (74.67%)、4842 (81.78%)和1317个(86.7%)DEGs进行了的GO注释分析。在生物过程类中，细胞蛋白质代谢过程最为显著，说明盐处理下水稻芽体具有广泛的代谢活动。在细胞成分类别和分子功能类别中，细胞部分和催化活性分别是最具代表性的分类。
为了进一步研究参与和富集在不同代谢途径中的DEG，使用KEGG数据库进行途径分析。结果显示，TWG与TIR的3227个DEGs中的485个、WG与IR的4177个DEGs中的782个、IR与TIR的5921个DEGs中的1407个以及WG与TWG的1519个DEGs中的401个分别被注释。在显著富集的途径中，苯丙烷生物合成途径含有较多的DEG。这一结果表明，苯丙烷生物合成途径可能对盐响应基因的表达具有调控作用。这些注释将为水稻盐胁迫反应途径的研究提供有价值的信息。
8 候选基因分析
QTL-seq分析发现了一个共同的QTL，命名为qRSL7(表1)，区域连锁图谱分析将该区间从4.17Mb缩小到222kb(图7)。在222kb区域内，基于RAP-DB数据库预测了27个基因。为了检测候选基因，研究人员结合了QTL-seq和RNA-seq结果，只选择了候选区域内IR与TIR和WG与TWG中的DEG。在27个预测基因中，有5个基因在盐胁迫下有差异表达。因此，这5个DEG被选为候选基因进行进一步验证。此外， Os07g0569166、Os07g0569700、以及Os07g0572075在WG与IR或TWG与TIR中也有差异表达，并且Os07G0570575在WG与IR和TWG与TWG中均显著下调。而Os07g0570500显示WG与IR或TWG与TIR之间没有明显的上调或下调。
为了验证RNA-Seq结果的准确性和重复性，采用qRT-PCR方法比较了IR36和卫国这5个基因在正常和盐胁迫条件下的表达水平。5个基因的验证结果如图8所示。根据RNA-seq结果，4个基因Os07g0569166、Os07g0570500、Os07g0570575和Os07g0572075在TIR中的表达均比IR上调。此外，与TIR相比，Os07G0569700在IR中表达下调。在WG和TWG中没有显著差异表达的基因。qRT-PCR结果与RNA-seq数据是一致的，但绝对表达水平显示出一些差异(图8)。此外，为了验证这5个基因在F2：3群体中的表达，研究人员从199个F2：3群体中分别选择了5个RSL高、低、中表型个体。在盐胁迫下，Os07g0569700在低RSL品系中表达下调，其余4个基因在低RSL品系中表达上调，在高RSL品系和中等RSL品系中没有明显的上调或下调。
9 水稻耐盐性相关候选基因的筛选
为了进一步获得确定最可能的候选基因的有力证据，对IR36和卫国的5个候选基因进行了测序。序列分析表明，Os07g0569166、Os07g0570575、Os07g0572075的cDNA序列和启动子区域在两个品种中没有差异。Os07g0570500的CDS区，与卫国相比，在IR36中检测到一个单核苷酸多态性(T到C)，但研究人员使用ProtParam发现该单核苷酸多态性没有引起氨基酸变化。只有Os07g0569700启动子区域，与卫国(图9)相比，IR36含有1bp的插入(ATG起始密码子上游879bp)。接下来，研究人员设计了一个KASP标记，利用1bp的插入序列对两个亲本和199个F2：3品系进行了基因型分析，并进行了区域连锁定位分析。对母本基因型、父本基因型和杂合子基因型与RSL的相关性分析表明，基因型与表型呈显著正相关。方差分析结果表明，母本基因型与父本基因型、母本基因型与杂合子基因型、父本基因型与杂合子基因型之间的差异均达到显著水平。这些结果表明，KASP标记与盐胁迫下F2：3群体芽期耐盐性显著相关。
因此，Os07g0569700被认为是qRSL7最可能的功能基因。候选基因Os07g0569700在先前的研究中已经被研究并命名为OsSAP16。该基因编码一种与胁迫相关的蛋白，其表达已被证明在干旱胁迫下会增加。
结论
本研究利用QTL-seq、区域连锁定位分析和转录组测序等技术，对盐敏感品种IR36和耐盐品种卫国杂交F2：3群体的芽期耐盐基因进行了定位。与水稻芽期耐盐性相关的主效QTL qRSL7位于7号染色体上的222kb区间内，包含5个表达差异显著的候选基因。通过qRT-PCR和序列分析，发现OsSAP16是控制水稻RSL的候选基因。本研究为水稻芽期耐盐基因的鉴定提供了一种快速、经济有效的策略。
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