​肿瘤细胞外囊泡：分离和分析方法的进展和挑战（内含赠书福利）

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通过分析生物流体中的细胞外囊泡（EV）研究实体瘤的可能性是癌症研究中最令人兴奋且发展迅速的领域之一。细胞外囊泡是在生理和病理条件下均释放的微小囊泡，可用于监测多种病理状态的演变。实际上，这些囊泡带有生物学信息，并且可以通过转移蛋白质、DNA、RNA和microRNA来影响受体细胞的行为。在这篇综述中，作者分析了收集生物流体样品（尿液、血浆/血清和细胞上清液）以及分离和定量细胞外囊泡的方法，这些方法的优点和缺点。此外，作者概述了最常用于分析细胞外囊泡分子成分的方法（例如数字PCR、下一代测序、反相蛋白质微阵列、流式细胞仪等）及其优势。尽管对细胞外囊泡有极大的科学兴趣，但是仍然存在很大的不确定性，即哪种是收集、分离、定量和分子评估的最佳方法，并且需要进行标准化。细胞外囊泡的功能使其成为基于液体活检的生物标记物的理想选择。然而，细胞外囊泡的体积小，使其分析非常困难，并且需要多种先进技术，因此也面临一些困难。

（一）该综述首先介绍了EV的基本概念、形成机制、研究历史、作为检测生物标志物的重要性等。

A）过去30年的细胞外囊泡（EV）研究的直方图。在过去的十年中，人们对EV的兴趣急剧增加。直方图是根据PubMed检索的EV研究（关键字：extracellular vesicles, exosomes, or microparticles）生成的。通过阅读标题和摘要来验证得到的文章，以确保是EV相关研究。B）外泌体起源于多泡体（MVB），是晚期内体来源的细胞区室，MVB向内出芽形成腔内囊泡，MVB膜与质膜融合，最后将MVB内的小泡释放到细胞外形成外泌体；微泡直接来自质膜。

（二）其次，该文介绍了样品收集和储存，包括血液、尿液、细胞上清。

（三）接着介绍了EV的分离方法。包括差速（超速）离心法、免疫吸附法、商业化提取试剂等。以及外泌体提取方法所面临的挑战。用于分离EV的所有方法都有其优点和缺点，并且针对特定应用选择最合适的方法并非易事。这是一个重要的问题，因为使用的分离技术可能会影响分离出的EV的分子成分和生物活性。由于这些原因，需要标准化纯化标准，以在所有研究实验室中获得可重复的数据，并促进EV在临床中的应用。

（四）EV的鉴定方法。该文主要介绍了电子显微镜（TEM）、原子力显微镜（AFM）、动态光散射（DLS）、Western Blot。

（五）EV的下游分析：数字PCR、组学分析、流式细胞术。新一代流式细胞仪（flow cytometers, FC）. 与传统的流式细胞仪相比，新一代流式细胞仪采用灵敏度更高的检测器，可以通过前向或者侧向散射信号进行粒径大小的分析，甚至可以根据粒径需要选择不同的激光作为分析光源。例如Cytoflex（Beckman Coulter) 通过检测405nm激光激发小颗粒产生的侧向散射光信号进行纳米级颗粒的检测，根据之前的分享一种新型增强光散射灵敏度的流式细胞仪用于生物纳米颗粒的分析,也表明CytoFLEX可以检测到低至81 nm的病毒和至少小至65 nm的EVs.

表征细胞外囊泡最常用的方法。A）TEM（透射电子显微镜）、DLS（动态光散射）和WB（Western blot）分析。B）新一代流式细胞仪，可分辨小至150 nm的颗粒：图像显示使用Cytoflex流式细胞仪（Beckman Coulter）对Megamix微球（100至200 nm）的测量。

液体活检是癌症研究中的重要课题，这要归功于有关导致肿瘤发展的机制的最新发现以及新的分子研究方法的出现。液体活检可以通过简单的生物体液测试来早期诊断和随后监测疾病。液体活检的目的是通过对恶性肿瘤的准确且非侵入性的遗传和分子分析代替肿瘤组织分析，从而实现个性化治疗。如今，人们认识到EV参与了细胞间通信，并参与许多疾病的发生发展。EV的功能使其成为基于液体活检的生物标记物的理想选择。实际上：i）EV具有组织特异性； ii）EV的货物（RNA和DNA）受到保护，免受核酸酶降解； iii）EV代表了细胞生理和病理状况的一面镜子。因此，EV可以帮助医师在肿瘤疾病各个阶段为每个患者选择最佳治疗方法。然而，EV的体积小，使其分析非常困难，并且需要多种先进技术，在当前是一个挑战。而且，为了在临床水平上转化EV的研究，方法的标准化将是很必要的。因此，尽管EV是癌症研究中最令人兴奋和迅速发展的主题，但我们离EV在临床实践中的应用还很遥远，需要进一步的研究来理解和利用这种巨大工具的所有潜力。

参考文献：Extracellular Vesicles in Oncology: Progress and Pitfalls in the Methods of Isolation and Analysis