静息态功能磁共振成像通过分析特定大脑系统自发活动的相关模式为理解人类与非人大脑的功能结构提供了巨大帮助。当被试在核磁舱中扫描静息数据时，这种自发的神经活动可以借由血氧依赖（BOLD）信号间接地被测量到。包括疾病模型以及脑组织去除等在人类中无法通过伦理审查的实验设计都可在动物模型中进行。非侵入式功能核磁成像方法也为跨物种的分析比较提供了一个很有前途的工具。本文综合介绍了静息态功能性连通分析的原理及其在活体动物模型中的应用。这里我们主要针对动物模型到人类应用上的迁移进行介绍，同时也介绍了对功能核磁的非人脑血液动力学研究，对数据后处理中的方法学问题以及不同抽象级别的功能数据做出了解释。提出了将功能像数据得到的连通性信息与基于光学成像以及追踪等方法获得的结构连接信息进行整合分析的研究目标。这使得我们可以从信息流的角度对功能影响进行分析，并分析其结构基础。本文发表在Frontiers in Neurology杂志。（可添加微信号siyingyxf或18983979082获取原文）在没有任务刺激的情况下我们采集到的就是所谓的静息态核磁影像数据，我们从中发现了一种内在的固有的连通性现象。1995年，Biswal及其同事发现解剖位置与空间位置不同的区域，其fMRI信号在低频波段出现相干的现象。而已有许多研究表明静息状态下采集的fMRI信号的自发波动维持了具有一定的生理学意义的功能活动。而这些功能活动在定义上包含了大脑系统内的拓扑结构系统，而不包括如运动、心跳以及呼吸等生理活动等。这些具有里程碑意义的研究结果得到了包括正电子发射断层扫描（PET）、脑磁分析(MEEG)、光学成像、单位局部场记录以及脑电（EEG）等不同方法学研究的进一步支持。如今这种对自发性fMRI信号的研究已经成为探究大脑功能性组织的主要且迅速发展的领域。总之，基于活体的功能影像已经成为加速对健康和患病大脑表型研究并增加对其了解的重要工具。除了静息状态外，大量研究还证明fMRI信号在包括睡眠、麻醉、昏迷等低意识状态下以及在发育、衰老等脑成熟度不同的发展状态下，其自发活动也有一定的差异。其另一个让人信服的方面在于发现包括小鼠、大鼠、兔、狗以及鸽子等不同物种之间也存在有组织的自发性大脑活动。而这些研究中以大小鼠以及猴子为主要的模型动物。本文主要介绍了磁共振成像的原理，并对其在动物模型中的应用做了详细介绍。我们还将从实验设计到数据采集的方法等问题进行讨论。讨论的重点将集中在由动物脑疾病模型到人类临床的迁移应用等新兴概念，这可能成为产生新治疗方法的基础。由于现在还没有相应的体外或者计算机模型可以模拟大脑的生理活动，所以这种基于活体动物的连通性分析模型还是无可代替的。本文将提供对包括体素统计和功能连接的图论分析等更加广泛的分析方法及其在不同抽象层次上解释的新见解。相对于在人类应用中的指数式增长，静息态成像分析在非动物模型上的研究却很少出现。在活体动物中进行的静息态fMRI研究将加速对大脑病理生理学上迁移模型的解释能力（图1）。而已有研究表明动物模型的生理条件将会影响大脑的工作和功能连接模式。而人类和动物的大脑功能网络具有相似的组织特征，并支持与行为密切相关的感知和认知核心属性。动物模型允许进行基因编辑，以洞察功能性大脑组织在不同疾病模型中的改变。合适的功能连接性度量指标可以用作替代或潜在的生物标记，并可结合新的治疗策略形成新的理解。
Rs-fMRI揭示的功能网络为跨物种的大脑功能分析提供了更为全面的描述。在特定任务下相互作用的脑区倾向于整合在相应的功能网络之中。Smith及其同事在超过3万例被试的fMRI数据集中进行了开创性的研究，发现基于任务激活的区域要远远低于功能运作时耦合的神经元范围。现在已有许多研究神经活动与血液动力学反应耦合的潜在机制。已有针对于预演、学习巩固、未来准备于神经元层面上兴奋性变化的建议，但是还没有确凿的证据来支持这些猜想。如基于大鼠在不同生理状态下的分析结果所示，虽然麻醉等因素会影响功能连接模式，但是，在包括默认网络等相对明确的网络成分中功能连接是相对稳定的，其完整性及拓扑属性基本保持不变。
因为维持大脑持续活动需要耗费许多能量，所以可以从代谢的角度得出关于大脑持续活动在所有物种中基本作用的进一步结论，跨物种的大脑活动组织在经济运行上都得到了优化。这与哺乳动物大脑保持了基本的大脑活动这一现象是一致的。而与物种大脑的大小无关。脑振荡是跨物种拓扑结构的基础，符合进化过程。此外，我们也假设低频波段的信号是一个神经系统的一般特征。目前，对这种自发性活动及其神经生理学基础仍在研究之中。动物研究模型在神经科学领域起着关键的作用，它极大地帮助我们理解了各种条件和疾病的运作机理。动物模型对医学和神经科学以及人类和动物健康的可持续发展做出了实质性的贡献，益处重大。来自跨物种的功能连接研究比较认为，大脑网络的功能性交互支撑着多种认知过程，并为生存提供基本支持。有大量证据将异常的功能连接状态模式归咎于多种精神状态、神经与发育障碍等。由于基因编辑技术的发展使得我们可以对啮齿类动物的基因进行编辑，控制基因表达，从而成为研究人类神经病理学的重要工具。而另一个挑战在于对正常老化与病理性的神经退行的区分识别。包括阿尔兹海默、帕金森以及肌萎缩性侧索硬化（渐冻症）等神经退行性疾病来说，其病理性变化过程可归结为不同的亚临床或者临床阶段。在不同神经退行性疾病阶段的大脑功能性组织的动物模型可允许定义可能的替代物，以用于可能的替代标志物和增强的药物试验。神经退行性病变的转基因小鼠模型显示出与人类发现一致的异常功能连接模式。特别是这些来自对胆固醇转运蛋白载脂蛋白ε（ApoE）突变小鼠的研究发现，这种小鼠的基因型与发生神经变性的风险增加有关。在ApoE小鼠突变体中，功能连通性已成功用作评估改善大脑连通性的饮食疗法的一种手段。与野生型动物模型相比，Cx3cr1KO小鼠通过使用功能连接性度量作为神经发育障碍的间接指标，证明了小胶质细胞在发育过程中促进回路连接成熟的作用。该研究解决了小胶质细胞的突触修剪和功能连接的神经化学机制之间的差距。转基因模型中的许多如自闭症这类研究报告了与表型相关的异常功能连接。动物的标准化脑损伤模型尚未建立。在动物模型中研究在受控条件下与创伤性损伤相关的功能改变，可以获得关于功能连接改变模式和后恢复期影响的详细理解。我们可以假设大脑区域性损伤对功能性脑网络产生影响，这种损伤可能引发功能性重组作为一种代偿性反应。在动物实验中，这种影响及其位置可以与表型一起控制，而这类实验设计在人类中是不可能的。针对创伤性损伤结合行为相关的功能性组织的研究可能是一个有价值的研究方向。因此，只要我们还没有一个完善的大脑模型被证明可以模拟大部分大脑功能障碍并对不同表型治疗方法进行模拟，同时还可以提供所有足够复杂的神经和神经化学特性，那么我们就需要这样的一个动物模型尽可能接近复杂的人类大脑结构。过去几十年的医学进步巩固了其在治疗概念中的发展，最终基于动物模型的研究可能为神经退行性疾病的治疗铺平道路。有许多研究报告了神经和精神疾病内在功能活动结构的改变；因此我们在此回顾了利用rs-fMRI对动物模型的迁移性研究。其中包含疾病或者结构摘除等多种不支持用于人类的实验设计。此外在人体研究中较难进行的离体组织分析在动物模型中也更加易于实现与验证。而目前大部分的功能连接性分析都使用非侵入性的fMRI方法这一可实现跨物种比较的工具进行分析。静息态fMRI数据采集的基本原理
人类的实验中，只要让被试在扫描舱中保持约5分钟左右闭眼无任务刺激下的扫描，即可获得所谓的静息态功能影像数据。事实上对于静息的定义使用较为简约，在任务态的核磁数据扫描中，静息被用作block设计中的控制条件。这种基于人类实验定义的静息状态或者任务态研究中的无任务条件在动物实验中变得越发复杂且不易实现。在包括小动物在内的动物中，绝大多数rs-fMRI研究需要麻醉，以最大程度地减少运动伪影、生理压力和训练要求。由于fMRI数据采集过程中的高度敏感性，运动噪声是一个关键问题。尽管控制静息条件以及麻醉和意识状态的各种类型有局限性，但即使在不同物种之间，功能数据在很大程度上也是具有可比性。静息态功能磁共振成像是一种T2加权信号，其对神经驱动的氧合-脱氧血红蛋白比例的变化敏感，即血氧水平依赖(BOLD)，它会改变磁性。最终的功能磁共振成像数据集由一系列回波平面图像组成，即在扫描过程中等距获得的体积。每个体积的体素大小是相同的，由此确定了空间分辨率；记录每个体积所需的时间(重复时间，TR)定义了时间分辨率。表1提供了在关键实验室动物中用于rs-fMRI数据采集的常用扫描参数的代表性示例。体素大小因物种而异，也取决于MRI扫描仪，而大脑体素的主体数量在物种之间相对恒定。例如，用于扫描小鼠的11.7T超高磁场下全脑扫描的典型体素大小约为150微米150微米，层内分辨率约为250~500微米；相比之下，人类现有技术3 T的典型空间分辨率约为2mm ，层间厚度约为1.5~3mm。较小的体素尺寸需要牺牲信噪比和降低的时间分辨率为代价更好地分离不同的组织类型。覆盖不同组织类型的较大体素尺寸可能会包含来自不同神经元群体的组织信号，这种现象被称为局部容积效应。一般时间分辨率通常约为2 s，适合于测量慢频率波动(< 0.1 Hz)，即频率范围在(0.01 < f < 0.10 Hz)的超慢波。然而，重复时间与奈奎斯特香农采样定理(数字信号处理的基本定律)产生的限制有关，即所研究的频带限于0 < f < 1/ (2 TR)。Tat表示，对于TR = 2 s时，可研究的最高频率为0.25 Hz，所有例如约1 Hz的心脏脉搏如大于 0.25 Hz信号都会使信号混叠，无法滤除干净。因此，不可使用rs-fMRI研究其他频带，例如范围从低频 (0.1±1.0Hz)和δ至γ(25–100Hz)的典型EEG频带。但是通过使用加速技术允许更快速地完成全脑的影像采集，不少相关研究也在不断优化空间和时间分辨率。
表1 推荐的扫描参数
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数据处理业务介绍：
尽管在活体动物中，rs-fMRI数据采集也相对容易，但分析却并非如此。现在已经提出了几种主要的降噪方法。所测量的信号显著地受包括运动伪影，呼吸，心脏脉搏在内等非神经信号混淆，以及它们随时间的变化，在我们的数据中仅有4%的信号为我们需要解释的神经信号。因此，fMRI信号的绝大多数预处理流程是rs-fmri信号的降噪，即提取神经驱动的fMRI信号。
经典的fMRI数据处理包含空间信号处理以及时间信号的处理，空间信息上的处理包含运动校正以及空间平滑；时间信息上的处理包含减均值、去线性趋势、带通滤波和噪声变量的回归以及与标准空间的配准。这些预处理步骤在多个物种的数据预处理中都是通用的。即使处于麻醉状态下也会由于呼吸、心跳和肌肉松弛而产生运动伪影，因此大多数的功能核磁成像研究都会对运动伪影进行了校正。头部运动会导致严重的图像质量下降并可能导致假阳性功能连接的产生。计算每个时间点相对于第一个或者平均时间点的平移或者转动的变换，通过这些信息用刚体变换的方式对每个时间点进行运动校正。而一些研究人员建议将收到运动噪声影响的图像排除在分析之外，并给了模拟运动对fmri信号影响的详细方法。而空间滤波一般使用三维的高斯平滑核，对每个时间点的图像作平滑操作，以降低空间分辨率，提高信噪比。其主要设置为在x,y,z三个维度上的FWHM半高宽，一般推荐平滑核为扫描得到的体素的两倍大小，以一个体素长宽高为4百微米的体素为例，选择的高斯平滑核大小以8百微米为宜。
在静息态功能磁共振数据采集中由于设备产生的信号漂移，可通过去线性趋势的方式去除漂移的影响，即通过减去每个体素在对应时间点的线性拟合值来实现。每个个体的时间滤波一般使用范围为[0.01,0.1]Hz的带通滤波器进行处理。时间滤波的目的在于将信号波段限制在由于自发性神经活动振荡引起的低频振荡范围。通常来说开始扫描时机器的瞬时响应以及在麻醉情况下仍然会由于呼吸、心跳甚至头动等运动也会对影像产生影响，这里为了消除瞬时响应以及被试适应扫描环境的影响，我们一般会舍弃5到10个靠前的时间点信息。
为了进一步去噪，大多数研究人员会在一般线性模型中使用非生理信号作为回归因子来去除其的影响。而这些协变量主要来源于对头部运动的估计以及部分的组织信号，此外也可使用其导数及其后向差分值作类似的处理。基于组织信号的处理可以回归全脑平均信号、脑脊液信号、白质信号以及颅骨或者背景噪声的杂波信号等。总而言之，尽管在扫描后rs-fMRI数据的降噪和去伪影等处理依然具有挑战，预处理还是在改善动物MRI扫描数据质量过程中不可缺少的重要步骤。而这些预处理与在人体中进行的预处理也是相似的。现在有许多技术可以对rs-fMRI信号降噪处理，但是还没有一个金标准。这些处理的效果取决于所采用的预处理步骤及其顺序。标准预处理流程可以包括以下步骤：运动校正、重采样、去除非生理信号、时间滤波和空间平滑。应根据MRI采集参数、物种特异性特征和研究的总体目标仔细选择预处理流程的步骤及其顺序。表2提供了近期动物rs-fMRI研究中常用预处理技术的综合总结。
数据到标准空间的配准处理
对于不同动物被试的多个扫描时间点而言，将其对准到统一的标准空间十分重要，这关系到后续对相同脑区的定位分析。也就是我们所说的配准操作。好的空间配准在MRI数据处理中仍然是一个重大的挑战。基于人体的研究人员通常将图像转换到MNI标准空间。常见的做法是线性和非线性配准算法。对于动物MRI数据，尚未出现这种公认的标准空间，即使对于关键实验室动物也是没有的。但是，来自艾伦脑图谱的小鼠，人类和其他非人灵长类动物的成年和发育中大脑的神经解剖信息可以用作相应标准化处理中的模板。例如，艾伦小鼠脑图集包括全彩、高分辨率的解剖图谱，以及系统化、分层组织的小鼠脑结构分类，可以用作空间配准的基础。其已经使用标准化的标记、追踪和轴突连接成像定义了中等尺度的整个小鼠大脑的连接图谱。尽管已经获得了小鼠的中尺度结构连接结构定义的支持，但是到目前为止，还没有提出小鼠大脑的功能性分区。但是对于大鼠，已经发布了针对大鼠大脑的具体组织分割模板。
通常可以利用不同的算法对单个被试图像作组织变形，将所有图像配准到共同的回波平面图像模板来实现空间标准化。这些常用的算法使用多参数变换，然后进行非线性均方差匹配。对于动物MRI数据和人类而言，这些空间标准化方法基本上是相似的。一般来说配准质量主要取决于所使用的模板。所使用的模板图像可以是一个预先定义的模板，例如用于人类的MNI模板，或者可以通过对多个不同研究对象，例如整个研究人群、有关表型、年龄、扫描仪方案的队列等，进行计算平均像来创建研究特定的模板，由于已经在公共空间中进行了转换，因为已经消除不同年龄等条件的差异影响，建议将其用于空间配准处理。最新的动物fMRI分析技术使用了一个数字化版的小鼠大脑图谱，用于创建fMRI数据分析模板。以狗的静息态分析为例，狗是一个很少用于静息态分析的物种，不存在公认的大脑图谱，通常我们会使用一只狗的功能图像作为模板，将其他狗的数据与之匹配。Müller等人基于人体的研究结果提出了一种在配准到公共模板之前基于特征点的空间标准化流程。通常按照Ashburner和Friston的基本思想，即以局部强度的平方差最小化为原则，通过将单个回波平面图像用非线性标准化到研究特定模板上来完善标准化过程。总而言之，归一化的质量决定了比较受试者或组之间结果的效力。些许的误差是任何标准化程序所固有的，并且单个大脑解剖结构的差异无法通过标准化来完全克服。
基于功能连接性的大脑分区：
对于空间标准化，模板是必需的。模板通常指的是基于图谱的各个物种的标准脑。但基本的大脑结构不能捕捉功能分离的模块，也就是图论下的节点，因为它涉及在单个节点内混淆不同时间过程的风险。整个大脑中节点的定义是有挑战性的，但对于可靠的功能连接性分析来说是必不可少的。包括独立成分分析在内的数据驱动方法已经被引入到大脑区域划分和描绘人类以及啮齿动物的静息态功能网络中。基于图论的方法不需要先验信息为功能性脑网络识别提供了另一种数据驱动的方法。图论分析为人脑引入了一种数据驱动的全脑功能分组算法。最终发布了包含多达300个功能相似的分区图谱。将这种数据驱动的程序应用于动物的rs-fMRI数据可能有希望更准确地研究功能性脑组织，这在分析组间或跨时间的行为差异分析时非常重要。
功能连通性的测量
在rs-fMRI数据经过预处理之后，可以使用包括相干性，频谱分析，动力学以及时间序列之间的因果关系测量等多种功能连通性分析方法。信号相似性的最简单度量指标是皮尔逊相关系数，它被广泛用于测量低频BOLD信号的区域间连通强度，并且可以定义功能连通性网络（图3）。感兴趣区域或是ROI也称为种子点的定义取决于研究设计，并且从定义上讲都是假设驱动的方法，与数据驱动的独立成分分析相比，这是一种复杂的信号分解技术并允许分离各种独立信号来源。两种技术均已成功应用于研究人类和活体动物的脑功能连接。
图3 假设中的功能连接模型与疾病以及行为之间的关系从大脑的细胞级别体素分割获得区域到区域的例如皮尔逊相关这样的连通性度量的集合可以用于更加抽象的图论分析。大脑的功能组织在全脑尺度和细胞水平上具有复杂网络的特征。不同物种大脑中与连接结构相关的差异在从简单到高级物种的整个范围内遵循一种异速的比例关系。诸如高度连接的神经元群体(中枢)、模块化、重要节点组成的富人俱乐部组织和高效的小世界拓扑属性等特征，都可以通过跨物种的图论来系统地量化。在评估连通性和连通强度上，已有数学工具方面取得了最新进展，其对于动物核磁分析这样的小样本来说尤其有用。基于PET的连通性分析证明，即使样本量接近或小于所研究的脑区域数量，图论模型也能可靠地估计逆协方差，这使其有望成为rs-fMRI研究的有效工具。此外，图论模型允许进行基于图论的分析，并已被证明这些属性可在非监督分类框架中可以以其为根据进行区分。这些分类和无监督学习算法的方法可以根据人类研究证明的从影像数据中提取的特征，例如根据疾病模型进行分类。多参数研究的概念设计（如图1所示）突出了纵向测量的重要性。随访数据能够研究受试者体内功能连通性随时间的变化。这在研究发育过程或追踪疾病传播过程时特别有用。关于受试者体内随时间变化的信息还需要横向比较各组的差异，以便研究多组，例如不同的表型，是否随感兴趣的时间段内的功能性脑连接改变而随时间变化。对于动物，特别是啮齿动物的纵向研究特别有意义，因为这项研究可以在整个生命周期内设计，而对人类的纵向研究则需要设计许多年甚至几十年才能捕捉到人类生命周期的相当一部分。基本来说，两个解剖上不同的大脑区域却在以有组织的方式进行神经沟通使得研究人员对功能相关的大脑区域之间低频BOLD信号的强相干模式引起了强烈怀疑。在静息状态下，甚至当受试者或动物处于麻醉状态时，人类和活体动物的大脑的许多区域似乎在功能上也会相互影响。这种潜在的神经生理机制的本质仍未得到充分解释。然而，关于功能性大脑组织可以得出许多结论。接下来的内容阐明了在健康和患病的大脑中通常观察到的rs-fMRI模式及其可能的解释。可以合理地假设，每一次偏离正常的连接都代表了大脑异常的可能病理状态，尽管在从静息到深度麻醉等不同条件下，潜在的持续BOLD波动的本质还没有完全理解。从基于种子的相关性分析中观察到，功能连接性可以在两个方向上改变，从而定义下降和增高的条件。这实际上是在细胞变性或分离的脑模块功能受损的情况下，直接解释了功能连接性的降低，最终可能导致完全断开综合征。如转基因小鼠所示，功能整合中断伴随连接性降低与认知缺陷以及不良行为表现。相比之下，增加的功能连接性（即更强大的BOLD同步）在解释方面更具挑战性，在人类研究和大鼠的各种神经退行性疾病中，功能连接性增加已得到证实。功能连接的增强通常被解释为对潜在病理过程的适应性反应，这可以通过功能重组补充额外的资源来解释，以补偿神经功能障碍并维持认知和身体功能。该模型得到了神经病理性损伤后大鼠的rs-fMRI研究的支持，其中已经证明了包括功能连接性增强模式在内的功能重组。临床水平上，帕金森患者表现出神经心理学上的正常认知表现，与年龄匹配的健康对照组相比，观察到的跨皮质功能网络的功能连接性增加的模式可能归因于功能代偿性重组，这与在大鼠中的发现基本一致。越来越多的证据表明，功能连接性增加可能是包括癫痫在内的神经疾病中大脑功能异常的第一个状态，这在大鼠和神经退行性疾病过程中得到证明，在包括癫痫病在内的神经系统疾病中尤为明显。考虑到在疾病的早期状态下功能连接性增加，并且在疾病的晚期状态下由于持续的细胞损伤而出现分离综合征，可以提出一个与行为表现相关的功能连接性改变的假设模型(图3)，即在保持正常行为的同时，当神经储备耗尽时，功能连接性增加。由于发展中的如神经退行性疾病细胞损失或相应如创伤性脑损伤功等模块的局部损伤，各个功能连接网络的核心节点会降低与网络其他节点的功能连接，并最终在功能上断开连接持续的细胞丢失而无缓解。从功能连接性增加到降低的短暂状态可能伴随着行为和认知的下降。在神经退行性疾病的无症状阶段，功能耦合似乎有所增加，这与我们的模型一致，并得到了最近一项关于遗传风险研究的支持。这进一步要求转基因动物模型来验证疾病过程中功能改变的建议模型，并且需要对动物进行研究以期在疾病发作之前确定功能性连接的异常模式。功能连接性增强的另一种解释可能是抑制作用的丧失，该抑制性作用可能导致与功能性连接异常增加相关的病理性边缘化。这将意味着大脑区域以连贯的方式过度边缘化，不再能够与彼此共享有用的信息或与其他功能模块进行交互。需要动物模型来挑战这一假设并更详细地研究功能连接性增加的病理生理原理。大脑是复杂系统的有效代表，在不同物种之间具有显著的特性。它由空间分布和功能分工化的区域组成，这些区域持续地相互共享信息。用于功能网络分析的图论分析提供了一种量化大脑功能系统属性的强大方法。在图论中，功能网络被定义为两个节点之间的一组节点（即功能隔离的大脑区域）和连边（即功能连接性度量）。正如在大脑功能性划分的背景下所讨论的节点的定义是一个关键因素。假设已经定义了一组一定数量的节点，基于图论的拓扑属性可以用广泛的指标来定量描述。功能连通性连接矩阵构成了图论分析的基础，并包含功能连通性的成对度量。许多如网络小世界属性这样用于表征功能性网络组织等包括基本概念，以及其他概念的有用的属性度量可以被计算出来。将要应用的图论指标应该根据明确的假设来指导，并且完全适合于动物模型中的功能连接性研究。例如，最近已将图论方法应用于研究暴露于应激事件前后的大鼠以及神经性损伤后大鼠的功能连通性。动物和人脑之间基于图论的连接结构分析的其概念几乎是相同的，并且已经证明，大鼠大脑拓扑的基本属性与人脑相同。总之，将功能性脑连接性建模为图形，其中节点是分离的功能模块，边缘是区域间的功能性连接强度，这为在迁移框架中研究多种神经和精神状况下的功能性脑组织开辟了新的途径。噪音和伪影的存在限制了大脑功能组织的研究，伪影去除不干净会从根本上改变rs-fMRI研究的结论。然而，尽管在fMRI信号降噪方面进行了许多先进且持续的努力，但是在神经驱动的BOLD活动和噪声之间实现完美分离几乎是不可能的。因此，谨慎地解释结果至关重要。 BOLD波动的性质和时间相关的特性是功能连通性的间接度量，并且在技术上已经成熟。 fMRI数据的标准化预处理流程无法完全克服嘈杂的BOLD信号的时空限制，得出的结论应始终结合该方法的限制。然而，分析技术的改进在很大程度上有助于提高结果的可靠性，这种结果必须在从跨物种的功能磁共振成像数据中得出的结论的背景下才能看到。意识的各种状态和可能的给药状态不能在正常的大脑功能连通性模式的可变性区分开。许多因素混淆了大脑的动态功能，如何确定一个稳健的方法来定义一个异常或病理状态仍然是一个挑战。必须小心解释功能连接性数据，因为基于阈值限制的网络连接性在阈值范围内必然是不稳定的。该方法的局限性已通过基于图论分解分析的方法得以克服，因此功能连接可充当特征，并且在各个对象之间表现得既稳健又可靠。抑制性和兴奋性神经元耦合对功能连接性度量的贡献无法消除。默认情况下，静息态数据的有限空间分辨率和BOLD信号的有限信噪比使空间平滑成为增加信噪比必要的预处理步骤，但代价是是灰白质边缘信号混杂。因此，团簇无法在完全分离灰白质。甚至在麻醉下也会出现动物头部运动引起的假象，这可能会导致rs-fMRI信号，并被认为会产生虚假的相关模式，在对结果进行任何解释时都应考虑这些模式。在过去几年中，由于病毒和非病毒追踪方法以及基于图像采集和重建的高通量技术的融合，啮齿动物大脑中结构连接的大规模测绘变得可行。艾伦小鼠大脑连接图谱倡议使用腺病毒在大量皮质和皮质下结构中系统地表达绿色荧光蛋白，然后使用基于连续切片和双光子成像的专用成像技术，为每次注射产生横跨整个小鼠大脑的成像数据集。一旦重建，结果就可以提供了中等尺度到细胞水平的连接。一项基于非病毒追踪系统的独立研究提供了一个具有中尺度分辨率的可比连接体图，其中可以识别皮质子网络。对于特定的亚网络，如基底神经节，已经获得了额外的具有细胞级别分辨率的连接结构数据集。这些结构信息为功能连接性数据的解释提供了一个概念框架，允许在功能磁共振成像数据中根据已知的区域间连接的方向性来选择子网络。然而，中尺度图谱的每个节点都由多个局部回路组成，这些微局部回路具有一定的长程和短程连通性。虽然这种神经元亚群可能无法通过功能磁共振成像数据直接检测到，但它们在大脑活动方面可能有显著的痕迹。这些子网络现在也可以利用基于病毒追踪的方式进行研究。换句话说，一旦观察到信息流在网络中的扩散，中尺度或细胞水平的结构数据集就可以用观察到的功能模式生成中涉及的最简单的神经元集合来直接解释它们的机制。特别是在理论上，连接的方向性在结构连接体中很容易确定，因为轴突的起源和它们的目的地是可以区分的；然而相互连接的密集网络的存在可能需要例如化学或光遗传学的方法来确定连接的因果性。相对于磁共振成像技术，当前的光学成像技术获得的中等尺度连接可以提供更高的分辨率，但是，结构连接不能提供连通的动态性变化信息，只能提供平均连接图的静态图像。此外，结构数据没有说明连接性相对功能重要性：来自调节性皮层下结构的少量轴突可能比大量皮层内连接性对功能网络的动态组织具有更大的影响。为了实现高分辨率连接组和fMRI连接图的最有效组合，有必要通过配准方法对不同平台的不同分辨率的数据集进行整合。理想情况下，使用光学显微镜获得数据也进行配准，从而在细胞水平上进行分析，使功能与结构连接在单个个体水平上产生关联。静息态功能连接分析是一种快速发展的研究脑功能组织的方法，已经成为人类和动物神经成像的一个主要领域。新出现的观点认为内在活动可能要比任务态分析提供更完整的大脑功能信息，这甚至为在麻醉动物中进行功能连接研究开辟了新的方向。利用适当的动物模型在各种临床条件中扩展rs-fMRI研究的使用，在正在进行的研究中是一个主要方向，这可能有助于形成一个以独特的方式理解这种模型中功能组织属性的方法学基础。对重要动物模型，如猕猴和啮齿动物等实验动物的功能组织的持续研究可能为未来成像替代标记物的定义提供支持，这可能支持新的因果治疗概念的发展。排除动物实验的处理方法在理解大脑功能方面存在许多限制。今天，包括各种模型在内的迁移框架对于研究整个生命周期或疾病的整个过程中的大脑功能和功能障碍比以往任何时候都更加必要。
