显微注射实验操作步骤
显微注射及其应用
显微操作是一门古老而又年轻的技术。显微注射分为原核注射、胞浆注射和卵胞浆内单精子注射。早在1966年，加州大学医学院医学院的Teh Ping Lin博士就针对原核注射的小鼠受精卵做了系统的研究。
而随着分子生物技术的迅猛发展和相关仪器设备的升级换代，显微操作技术的理论研究和操作方法也在不断更新，并且在很多研究方面都展显出愈发重要的作用，比如研究动物基因表达调控机制、制备乳腺或血液的生物反应器以及建立疾病动物模型等。
显微注射主要步骤
小鼠的显微操作技术主要包括小鼠准备、显微注射和胚胎移植三个部分。如下图：
小鼠的显微操作主要步骤
一、小鼠准备
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胚胎供体小鼠的准备
由于C57BL/6具有很好的遗传背景和胚胎学特性，目前用于显微注射的小鼠品系大多是近交系C57BL/6，或者是以其为亲本的杂交种。为了获得大量的着床前胚胎以满足显微注射的需要，在雌鼠交配前对其进行诱导超数排卵。
具体做法如下：
向成熟雌鼠腹腔内注射5.0 IU的孕马血清促性腺激素(PMSG)，一般是在下午13～14点注射PMSG，约在48 h后再注射5.0 IU的人绒毛膜促性腺激素(hCG)，并立即与雄鼠合笼。
翌日清晨，检查雌鼠的阴道栓，交配成功的雌鼠将用于回收胚胎。为了获得较好的超排效果，一般多选用3～6周龄的雌鼠。而雄鼠大约在8周龄以上达到性成熟，并且可以一直使用到其繁殖性能下降时（6～8月龄）将其淘汰。
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胚胎移植受体小鼠的准备
为了获得用作胚胎移植受体的假孕母鼠，一般会在进行胚胎移植的前一天，将结扎输精管的公鼠与自然发情的母鼠合笼。然后在胚胎移植当天的清晨，将见栓的雌鼠取出备用。假孕鼠一般用价格便宜，母性好的ICR或KM小鼠。
二、胚胎收集
将见栓的小鼠处死后，打开腹腔，小心地分离输卵管。接着将输卵管放进含有透明质酸酶的M2培养基中，刚排出的合子由于卵丘细胞包围，会在壶腹部形成一个“云雾团”，用钟表镊子撕开壶腹部，“云雾团”由于受到输卵管内部压力而被挤出。在透明质酸酶的作用下，合子逐渐脱去卵丘细胞，然后将合子在M2培养基中移洗一次，转入事先平衡好的KSOM微滴中培养待注射。
三、显微注射
显微注射的时间一般选择在中午至下午16点左右，此时小鼠合子的原核处于逐渐膨胀的阶段，比较容易识别和注射。显微注射用的持定针可直接装载于操作仪上，注意不要产生气泡。向注射针中装载注射用样品的方法可采用尾部虹吸法或者用Microloader Tip直接注入。
接下来进行注射：
用M2在载玻片上做一长形液滴，并用石蜡油覆于其上即可做成显微操作滴。用移卵管将一组合子转移到操作滴中。
于镜下观察，确定注射针针尖未堵塞，DNA液流顺畅。
在高倍镜下观察合子，选择双原核并且形态良好的合子。将持定针调整到邻近合子的位置，并调节压力以负压固定。要求原核应尽可能处于持定针的中轴线上。
持定针再稍加负压以确保将合子固定牢靠，微调焦距，使原核的边缘最清晰。然后再移动注射针，使针尖完全清晰。
推动注射针穿过透明带，进入卵胞质并慢慢接近原核。如果原核膨胀则表明注射成功。此时应立即将注射针撤出。
操作滴中所有合子注射完毕后，应置于KSOM中在37℃培养一段时间，用于下一步的胚胎移植。注意观察并做好记录。
四、胚胎移植
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准备工作
将小鼠称重并经腹腔注射麻醉剂。麻醉后，将小鼠置于垫板或纸上，以便于在显微镜下操作。
按常规手术方法拉出卵巢、输卵管和部分子宫角。
将注射后的合子吸入移植管。在吸入胚胎前可先吸2～3个小气泡，这样能够很好的控制液体的进出，并且对移植的成功有指示作用。
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胚胎移植
用钝头镊子夹住卵巢的脂肪垫将其拉出，并用小的血管夹夹住固定，将卵巢、输卵管和一部分子宫暴露于体外。
图片图片引自kumamoto university
在显微镜下找到输卵管的开口（输卵管伞）或膨大的输卵管壶腹部，一般选择这两个部位作为移植的入口。
调整好小鼠和输卵管的位置，将移植针插入输卵管伞，轻轻将胚胎吹入，若在输卵管内看到气泡就说明移植成功。
某些情况下，输卵管伞的位置不便于进针。此时，可在靠近壶腹部上游的位置切一小口，将移植针插入。
图片引自kumamoto university
松开血管夹，将卵巢、输卵管和子宫还原回体内，缝合体壁。
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术后护理
术后将小鼠置于干净的鼠笼内，盖住眼睛。可放在37℃的热台上，直到其苏醒。
五、注意事项
小鼠合子的显微注射是一项综合性的工程，在进行显微操作之前应大量阅读相关方面的文献和资料。首先，由于操作的对象是胚胎，不仅要保证在体外操作后的存活，更要关注在移植后体内发育直至正常小鼠出生的这段时期。
另外，对于各种显微镜的特性、显微操作仪的功能及使用注意事项都要有全面的了解，这样在使用时才能游刃有余。最后，就是持之以恒的练习，冰冻三尺非一日之寒。总之，细心和恒心是熟练掌握显微操作技术的不二法门。