科研 | Nature：拟南芥根和叶微生物群功能的交叉
本文由Jingzhi Zhang编译，董小橙、江舜尧编辑。
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导 读
健康植物的根和叶寄宿一些分类结构的细菌群落集合，这些群落的成员有助于植物的生长和健康。我们建立了来源于拟南芥叶和根，并且代表了大多数细菌物种的的可培养微生物群，这些细菌群可被独立培养重复检测排序。我们发现叶和根微生物群之间存在广泛的分类学交叉。基因组草图400分离物揭示了来源于叶和根的细菌之间基因组编码的功能性有很大的交叉，这些交叉基因在各个功能类别的水平上几乎没有显著差异。利用已确定的细菌群落和拟南芥生态型植物系统，我们发现这些分离株在其同源宿主器官上形成了类似于自然微生物群的集合，但也有异位叶或根定植的能力。虽然这增加了根和叶微生物群成员之间相互迁移的可能性，但基因组信息和重新克隆实验也为微生物群在各自的生态位上的专门化提供了证据。
论文ID
原名：Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota
译名：拟南芥根和叶微生物群功能的交叉
期刊：Nature
IF：41.577
发表时间：2015
通信作者：Yang Bai1等
通信作者单位：马克斯普朗克植物育种研究所，植物-微生物相互作用系
研究方法
1 拟南芥属植物的采样和根、叶、土壤源细菌的分离
拟南芥属植物要么从自然种群中收获，要么生长在不同的自然土壤中，通过菌落挑选、限制性稀释、细菌细胞分选以及基于16S rRNA基因的群落特征分析方法进行细菌的分离。为了获得代表性根定植细菌的文库，我们在抽薹前收获不同的土壤( 50.958 N，6.856 E，德国科隆；德国高尔姆，北纬52.416度，东经12.968度；德国威德尔多夫，北纬50.982度，东经6.827度；法国圣埃瓦兹克，北纬47.941度，西经04.012度；法国罗斯科夫，北纬48.725度，西经3.989度)。简而言之，拟南芥根在振荡平台上以180 rpm在洗涤缓冲液( 10mM MgCl2用于限制稀释，PBS用于菌落挑选)中洗涤20分钟，然后在5600 rpm下用3mM金属珠由在组织裂解器均质两次，持续30秒。将匀浆稀释并用于几种细菌生长介质上的分离方法详见（补充数据7）。对于基于菌落选择的分离，稀释的细胞悬浮液在固化培养基上进行电镀和培养，然后在培养最多两周后选择含有少于20个菌落形成单位（微生物群落）的培养板。为了限制稀释，将每个根池的均化根沉淀15分钟，并根据经验将上清液稀释、分配和培养在96孔微量滴定板中。在分离根源细菌的同时，对生长在科隆土壤中的植物根系进行了采集，并通过与培养无关的16S rRNA基因测序来评估细菌的多样性。另外，用PBS缓冲液冲洗土壤，以0.02%Silwet L-77为辅料，从未种植的科隆土壤中提取土壤源细菌，进行细菌分离和16S rRNA基因群落分析。为了分离代表性的叶际菌株，在南部的8个不同地点采集了自然生长的拟南芥植株（德国和瑞士，用于细菌分离的六个主要采样点，样本概况47.4090306 N，8.470169444 E，Hoengg，瑞士；47.474825 N，8.305008333 E，瑞士巴登；47.4816806 N，8.217547222 E，瑞士布鲁格；48.5560194 N，9.134944444 E，Farm，Tuebingen，Germany；48.5989861 N，9.201655556 E，Haeslach，德国；48.602682 N，9.213247258e，haeslach，德国；另外两个仅用于细菌分离的位点：47.4074722 N，8.50825 E，瑞士苏黎世；47.4227222 N，8.548666667 E，Seebach，瑞士），2013年春秋季用于细菌分离以及16S rRNA基因分析。采用强混声交替洗脱单叶定植细菌。随后过滤悬浮液( CellTrics过滤器，10μM，Partec GmbH，rlitz，德国)，以去除剩余的植物或碎片颗粒以及细胞聚集体，并将其应用于BD FACS Aria III (BD生物科学)上的细胞分选以及不同介质上的电镀详见(补充数据1和7 )。所有菌株随后储存在-80°C下30%或40%甘油中。
2 无关培养的拟南芥叶片、根和相应土壤样品细菌16S rRNA基因图谱。
使用454焦磷酸测序，也对用于细菌分离的部分拟南芥叶、根和相应的未种植土壤样品进行了细菌16S rRNA基因群体分析。冷冻根和相应的土壤样品均质化，DNA用溶解基质E (MP生物医学)在5600 rpm下提取30秒，DNA按照制造商的说明使用土壤快速DNA旋转试剂盒( MP生物医学)从所有样品中提取。冻干的叶子样品被转移到含有一个金属珠的2ml微量离心管中，随后使用组织裂解器( Retsch，Haan，德国)在25Hz下均质2分钟。均质化的叶子材料被重新悬浮在MOBIO PowerSoil DNA分离试剂盒(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德MOBIO实验室公司)的裂解缓冲液中，转移到供应商提供的裂解管中，并按照制造商的方案进行DNA提取。DNA浓度通过皮格林检测试剂盒( Life technologies )测量，随后稀释至3.5ngμl - 1。随后，使用针对可变区域v5-v7的引物（799f26和1193r6，补充数据7）扩增细菌16S rRNA基因[6]。用两种独立的PCR混合物（每个样品共6次重复，加上各自的无模板对照）将每个样品扩增三次。随后将三份PCR产物组合、纯化并进行454测序。对获得的序列进行解复用，并对质量和长度进行过滤(平均质量分数≥25，最小长度为319bp，没有不明确的碱基，条形码序列中不允许有错误) [27]。随后使用UPARSE[24]管道处理高质量的序列，使用Greengenes数据库[28]和PyNAST[29]方法对OTUs进行分类。
3 454焦磷酸测序法高通量鉴定叶、根和土壤来源的细菌分离物。
我们采用两步条形码PCR方案结合454焦磷酸测序来定义所有叶、根和土壤来源细菌的细菌16S rRNA基因的V5-V8序列(补充图1 )。通过在10μl缓冲液中溶解6μl细菌培养物提取分离物的DNA，Ⅰ含有25mMNaOH，0.2mMEDTA，在95°C下pH值为12，持续30分钟，然后通过加入10μl pH值为7.5的含有40mMTrisHCl的缓冲液Ⅱ来降低pH值。96孔微量滴定板中分离物的位置和分类通过两步PCR方案进行索引，使用含有孔和板特异性条形码的简并引物799F和1392R (补充数据7 )扩增可变区V5至V8。在PCR扩增的第一步中，使用2 U DSF-Taq DNA聚合酶、1×完全缓冲液( Bioron GmbH )、0.2mMdNTPs ( Life technologies )、0.2微米的96条条形码正向引物中的1条，用18 BP的接头序列(例如A1 _ 454 _ 799F1 _ PCR1 _ wells补充数据7 )和0.2μM反向引物( 454B_1392R )在25μl反应中。PCR扩增在以下条件下进行:DNA最初在95°C变性2分钟，随后在95°C下变性30秒，50°C下变性30秒，72°C下变性45秒，最后在72°C下伸长10分钟。将每个96孔微量滴定板的PCR产物合并，随后使用Agencourt AMPure XP试剂盒(贝克曼库尔特有限公司，Krefeld，德国)在两步程序中纯化，然后使用QIAquick凝胶提取试剂盒( Qiagen )从1 %琼脂糖凝胶中切下DNA片段。将每个96孔微量滴定板的PCR产物合并，用Nanodrop 法测量DNA浓度，并稀释至1ngμl - 1。在第二个PCR步骤中，在50μl反应中，用1.25 U PrimeSTAR HS DNA聚合酶、1×Primerstar缓冲液(均为法国圣日耳曼伦莱Takara Bio A . S )、0.2mM dNTPs ( Thermo Fisher科学公司)、0.2μM的针对18 BP接头序列的96条条形码正向引物(例如P1 _ 454 _ PCR2补充数据7 )和0.2μM反向引物( 454B_1392R )。PCR循环条件如下。首先，在98°C变性30秒，随后是25个循环，98°C变性10秒，58°C变性15秒，72°C变性30秒，最后在72°C伸长5分钟。PCR产物使用Agencourt AMPure XP试剂盒(贝克曼库尔特有限公司)和Qiack凝胶提取试剂盒( Qiagen )纯化，如第一步PCR扩增子纯化所述。DNA浓度由皮格林DNA分析试剂盒( Life technologies )测定，样品以等量混合。最终PCR产物文库在罗氏454基因组测序仪GS FLX +上测序。每个序列包含一个平板条形码、一个井条形码和V5-V8序列。对序列进行质量过滤，根据井和板标识符进行解复用[27]。UPARSE算法将OTUs聚类成97 %的相似度[24]。基于核苷酸的爆炸( v. 2.2.29 )用于将分离的OTU的代表性序列与培养无关的OTU对齐，并且仅考虑覆盖序列长度至少99 %的≥97 %的序列同一性。拟南芥叶( AT - LSBALE )、根( AT - RSBALE )和土壤细菌培养物集合的制备。基于来自这一点的OTU的代表性序列以及先前发表的独立于培养物的群体分析，培养物集合中与根、叶和土壤来源的OTU具有≥97% 16S rRNA基因同一性的细菌微生物群落在单个群体用于接种液体培养物之前，通过在各自的固化培养基上连续三次接种来纯化。这些液体培养物用于用799F和1392R引物进行Sanger测序的验证，以及用于培养物收集的甘油储备的制备和全基因组测序基因组DNA的提取。总共有21株来自叶的菌株，以前被描述为叶球细菌[8,9]，被添加到AT - LSBALE集合中，尽管在目前的独立于培养的叶群落图谱中无法检测到这些菌株。
4 用于全基因组测序的细菌基因组DNA的制备。
为了获得我们培养物中细菌分离物的高分子量基因组DNA收集时，我们使用了改良的DNA沉淀方案和Agencourt AMPure XP试剂盒(贝克曼库尔特有限公司)。对于每种细菌液体培养物，通过在3220g下离心15分钟来收集细胞，去除上清液，并将细胞在pH 7.5下重悬于5ml SET缓冲液中，该缓冲液含有75mM NaCl、25 mM EDTA、20 mM Tris/HCl。在混合物于37°C温育30分钟之前，加入总共20 μl溶菌酶溶液( 50毫克升1，Sigma )。随后，加入100 μl 20毫克升1蛋白酶K (Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen，德国)和10% SDS (Sigma-Aldrich Chemie GmbH )，混合，并在55°C下每15分钟振荡温育1小时。如果细菌细胞裂解不足，剩余的细胞在3220g下收集10分钟，并使用前24组织裂解器与裂解基质E管( MP生物医学)结合，在6300 rpm下均质化30秒。细胞裂解后，加入2ml 5 M NaCl和5ml氯仿，并在室温下通过倒置混合30分钟。在3220 g离心15分钟后，将6ml上清液转移到新鲜管中，加入3.6ml异丙醇并轻轻混合。在4°C下沉淀30分钟后，在3220g下收集基因组DNA分钟，用1ml70% (v/v )乙醇洗涤一次，室温下干燥15分钟，最后溶解在250μl洗脱缓冲液( Qiagen )中。将2μl 4 mg·ml - 1 RNase A ( Sigma - Aldrich Chemie GmbH )加入细菌基因组DNA溶液中，并在4°C下培养过夜。基因组DNA随后使用Agencourt AMPure XP试剂盒(贝克曼库尔特有限公司)纯化，并通过琼脂糖凝胶( 1% (w/v ) )电泳进行分析。基于装载的λDNA标记物( GeneRuler 1kb Plus，Thermo Scientific )估计浓度，并将约1 μg基因组DNA转移到微管搭扣AFA纤维小瓶中( Covaris公司，Woburn，马萨诸塞州，美国)。在Covaris S2机器( Covalis，Inc . )上，DNA被剪切成350bp的片段，连续两个30s循环(占空比: 10 %，强度: 4，循环/突发: 200 )。Illumina测序文库是根据ultra ultratm dna文库制备试剂盒手册中的Illumina测序文库是事先准备好的的。质量和数量在所有步骤都通过毛细管电泳进行评估(安捷伦生物分析仪和安捷伦Tapestation )。最后，通过荧光测定法对文库进行定量，固定化，用cBot (Illumina公司，美国)在流动细胞上进行处理，然后用TruSeq v3化学对其进行合成测序( Illumina公司，美国)。
5 基因组组装和注释。
对端Illumina读数使用TrimMomatic v. 0.3330进行质量和长度修整，并使用两种独立的方法进行组装( A531和SOAPdenovo32 v. 20.1 )。在每种情况下，选择支架数量较少的组件。每个测序分离物的详细装配统计可在补充数据3和4中找到。使用LIMIN V . 3.0233进行推定的蛋白质编码基因的鉴定和基因组注释。基因的功能注释使用Prokka v. 1.1134进行，SEED子系统使用RAT服务器API35进行。此外，KEGG正交( KO )组的注释通过首先为数据库36、37中的每个KO生成HmM模型来执行HmM工具包( 3.1b2)38。接下来，我们使用HmM模型使用HmM搜索工具搜索所有预测的ORFs，E值阈值为10×10 - 5。仅保留覆盖至少70 %蛋白质序列的命中，并且对于每个基因，选择具有最低E值的匹配。
6 测序分离株系统发育多样性分析。
每个蛋白质组都被搜索31个高度保守的单拷贝细菌AMPHORA基因39的存在，该基因是为基因组的高分辨率系统发育重建而设计的。随后，使用Clustal Omega40 v. 1.2.1对这些标记基因进行串联比对。基于这种多序列比对，使用FastTree41 v. 2.1，最大似然工具进行系统发育推断，推断出物种树。测序分离物的全基因组分类是使用分类器-tk42进行的，这是一种用于精确分类序列的同源/基于工具。基于所有分离株之间的成对树距离，对每个聚类独立进行系统发育多样性分析(补充数据5 )。
7 测序菌株之间功能多样性的分析。
通过为数据集中的每个基因组生成每个KO组存在/不存在的概况(或系统发育模式)，对测序分离株之间的功能多样性进行分析。随后，基于每对系统模式的Pearson相关性，计算了距离度量，这允许我们将每个基因组作为数据点嵌入度量空间。使用R中编写的自定义脚本在这个功能距离空间上执行PCoA。每个家族级集群内的成对功能距离是通过计算属于每个集群的所有基因组对之间的平均距离来执行的。最后，我们基于分配给每个类别的注释KO术语的百分比计算每个功能类别的RAs。使用非参数Mann - Whitney试验( MWT )，进行富集试验，根据基因组的起源(根对叶和根对土壤)来识别基因组组之间差异丰富的类别。使用Bonferroni方法对多次测试的P值进行校正，显著性阈值α= 0.05。
8 拟南芥叶片、根和土壤来源细菌的再培养实验。
煅烧粘土[16]是一种惰性土壤替代品，用水洗涤，高压灭菌两次，然后加热保温直至完全脱水。将塔利亚那Col-0种子用乙醇表面消毒，并在4°C下分层过夜。将培养物集合中的叶、根和土壤来源的细菌培养在96深的孔板中，随后合并(以相等或不相等的比例)，以制备合成细菌群落( SynComs )，用于低于叶和根承载能力的接种[43，44]。为了将Syncoms接种到煅烧粘土基质中，将OD600调节到0.5，并向70ml0.5×MS培养基( pH 7；包括维生素，不含蔗糖)，并在播种表面消毒种子之前，与100克煅烧粘土在洋红色盒子中混合(每克煅烧粘土约2.75×106个细胞)。植物在22°C、11小时光照和54 %湿度下生长。共孵育7周后，通过连续稀释根匀浆，根相关细菌的活细胞计数( 微生物群落)为每克根组织1.4×108±8.4×107个细胞。对于拟南芥植物的叶面喷雾接种，如上所述制备细菌融合体，并调节至OD600±0.2，然后用TLC色谱试剂喷雾器( BS124.000，Biostep GmbH，Jahnsdorf，德国)将溶液稀释10倍，并将170μl (约1.87×106个细胞)喷洒到每个装有四株三周大植物的品红色盒子中。每次喷射事件的平均体积通过重复喷射到50ml试管中并在前后称重来确定。经过7周的总培养期后，在无菌条件下收获所有植物和相应的未播种粘土样品。经过7周的总培养期后，在无菌条件下收获所有植物和相应的未播种粘土样品。在收获期间，使用消毒镊子和剪刀小心地分离单个植物的叶子和根，以避免交叉污染，然后单独加工。所有明显被粘土颗粒污染或接触地面的叶子都被小心地去除，并从进一步加工中省略掉。从一个洋红色盒子中收集的四种植物的剩余地上部分被合并并转移到裂解基质E管( MP生物医学)中，冷冻在液氮中并储存在80°C下，直到用于DNA提取。汇集一个洋红色盒子的根，在5ml PBS中以180 rpm洗涤两次20分钟，在灭菌Whatman玻璃微纤维过滤器( GE医疗生命科学)上干燥，转移到裂解基质E管( MP生物医学)中，冷冻在液氮中，并在- 80°C下储存，直到进一步加工。在颗粒沉降5分钟之前，将相应的未着色粘土样品在100mlPBS中以180转/分钟的速度洗涤10分钟，PBS中补充有0.02 % Silwet L - 77。通过在3，220克离心15分钟收集上清液。随后将颗粒重悬浮在1ml水中，转移到裂解基质E管( MP生物医学)中，冷冻在液氮中并储存在- 80°C下。
为了制备用于细菌16S rRNA基因群体分析的DNA，在针对可变区域V5-V7的简并PCR引物( 799F和1193R )扩增细菌16S rRNA基因之前，所有样品均质化两次每个样品在25μl反应体积中扩增三次(加上各自的无模板对照)，反应体积包含2个U DFS-Taq DNA聚合酶、1×不完全缓冲液(德国路德维希港Bioron GmbH )、2mM MgCl2、0.3% BSA、0.2mM dNTPs (德国Darmstadt Life Technologies GmbH )、0.3μM正向和反向引物以及10纳克模板DNA。在94°C下进行2分钟的初始变性步骤后，将目标区域扩增25个循环，其中94°C扩增30秒，55°C扩增30秒，72°C扩增60秒，随后在72°C下进行5分钟的最终延伸步骤。合并三个独立的PCR反应，通过添加20 U核酸外切酶I和5 U南极磷酸酶(均为德国法兰克福新英格兰BioLabs GmbH )去除剩余的引物和核苷酸，并在相应的1×南极磷酸酶缓冲液中于37°C下孵育30分钟。使用Illumina相容引物B5-F和96个差异条形码反向引物中的1个( B5-1至B5-96，补充数据7 )。使用第一步PCR的相同条件，将所有样品一式三份扩增10个循环。结合每个样品的技术复制，在1.5% (w/v )琼脂糖凝胶上运行，根据制造商的说明，使用QIAquick凝胶提取试剂盒( Qiagen )提取细菌16S rRNA基因扩增子。随后使用皮格林dDNA检测试剂盒( Life technologies )测量DNA浓度，并混合100千克每个样品。最终扩增子文库使用Agencourt AMPure XP试剂盒( Beckman Coulter GmbH )清洗两次，并在Illumina MiSeq平台上使用MiSeq试剂盒v3按照2×350 bp配对末端测序方案进行测序( Illumina Inc. USA )。
使用QIIME工具箱[27]，第180章( Phred ≥20 )中的脚本，正向和反向读取被连接、解复用并接受质量控制。如上所述，使用UPARSE24管道，将得到的高质量序列与叶、根和土壤分离物的Sanger序列一起以97 %的序列同一性进一步聚类。代表性序列的分类分配如前几节所述进行。仅对应于AT - RSBAL、AT - LSBAL或土壤采集中纯化菌株的一个或多个Sanger 16S rRNA基因序列的OTU被选择并指定为“指示OTU”。热图是使用ggplot2 R软件包生成的。
实验结果
1 根和叶中细菌培养物的收集
我们采用了三种细菌分离程序来建立拟南芥根和叶微生物群的分类多样性培养集合。使用从琼脂平板上采集的菌落、在96孔微量滴定平板液体培养基中限制稀释或者微生物细胞分选，从健康植物的集合或单个根或叶中回收细菌分离物(见方法)。我们通过测定≥550个碱基对16S核糖体RNA 基因序列，采用两步条形码焦磷酸测序协议[20]对培养细菌进行分类(补充图1；方法)。与此同时，部分根和叶材料被用于培养独立的16S rRNA基因群落测序，以交叉参考操作分类单元( OTU )定义的微生物群中的分类单元和培养物集合中的单个菌落形成单元( 微生物群落)。从主要生长于德国科隆土壤中的59个独立汇集的拟南芥根样本中总共回收了55812 微生物群落s，而从德国图宾根或瑞士苏黎世附近六个地点的拟南芥种群中收集的单个叶片洗叶液中回收了2131个微生物群落s(补充数据1 )。目前相关OTU的恢复估计值是使用两项早期研究的独立于培养概况6、12来计算的，前100个OTU (测序读数的70 % )的恢复估计值在54 - 65 %之间，相对丰度( RA )在52 - 64 %之间≥0.1 % (方法；扩展数据图1a - c；补充数据2 )。对于叶片样品，来自个体和集合叶片的独立于培养物的16S rRNA基因分析(来自六个位点的60个样品)显示了所有测试地理位点的相似群落特征和高的叶间一致性(扩展数据图2 )。前100名叶相关细菌OTUs (所有测序读数的86 % )的回收率估计为54 %，RA≥0.1 %为47 % (扩展数据图1d )。根源微生物群落对应于38个中的23个，叶源微生物群落属于45个可检测细菌家族中的28个。根和叶衍生的微生物群落各自代表了典型地与拟南芥根和叶相关的所有四个细菌门。因此，大多数与拟南芥根和叶有可再生关联的细菌家族都有可培养成员。
2 拟南芥叶片和根系微生物收集
在Sanger测序16S rRNA基因≥550bp片段和额外的菌株纯化(方法)后，我们从上述培养物集中选择了一组具有分类代表性的核心菌株。为了增加培养物集合的物种内遗传多样性，并且因为无法估计单个分离物对其相应OTU的数量贡献，我们包括共享≥97% 16S rRNA基因序列同一性(广泛用于细菌物种定义)的细菌菌株，但是代表独立的宿主定植，即从不同的植物根或叶中恢复。我们总共选择了206个根源分离物，包括属于四个门(指定为-叶源微生物)的28个细菌家族，以及224个叶源分离物，包括属于五个门(指定为根源微生物)的29个细菌家族(扩展数据图3a，b；补充数据1；方法)。此外，为了表示丰富的土壤OTUs (≥0.1% RA )，我们从未播种的科隆土壤中选择了33个细菌分离物，包括属于三个门的八个细菌家族(扩展数据图3c )
值得注意的是，大多数叶片分离物共享≥97 %的16S rRNA基因序列同一性，与在四项独立研究中报道的根相关OTU相匹配，在这些研究中，拟南芥植物已经在科隆土壤或其他欧洲土壤或美国土壤中生长(图1a中的内四个圆圈；方法)。类似地，大部分根系分离物与在蒂宾根/苏黎世地区的塔利亚那群或美国种植的植物(图1b中最里面的两个圆圈)中检测到的叶衍生OTU相匹配。这表明，绝大多数叶片和根系微生物群的代表在多个测试环境中（包括两大洲、欧洲和北美）共同填充相应的拟南芥器官。
基于16S rRNA基因Sanger序列的系统发育分析显示，206个叶片分离物中有119个( 58 % )与根系群系的相应16S rRNA基因片段有≥97 %的序列同一性匹配(图1a中的最外圈)。类似地，在224个根系分离物中，108个( 48 % )与叶片分离物共享≥97 %的序列同一性匹配(图1b中的最外圆)。叶源和根源细菌之间在细菌属和细菌科( 38个可检测科中的20个)的等级上的广泛交叉是值得注意的，因为我们从地理上相距很远( > 500公里)的环境中收集叶和根样本，这与之前关于葡萄球菌中叶和根微生物群交叉的报告一致。这种交叉被相应的独立于文化的叶和根群落剖面所证实(扩展数据图4 )。由于基本上所有的塔利亚那根相关细菌都是从周围的土壤生物群落6，7，12中招募的，这就增加了未种植的土壤也定义了大部分叶子微生物群落的起始接种体，随后选择生态位适应的生物。
图 1
3 收集微生物基因组分析比较
为了表征核心培养物集合的功能，我们对每个分离物进行了全基因组测序，并产生了总共432个高质量的基因组草案( 206个来自叶子，194个来自根，32个来自土壤；补充数据3 )。全基因组序列的分类分配证实了这些分离物跨越了广泛的分类范围，属于分布在五个门的35个不同细菌家族(补充数据4 )
基于全基因组分类信息，我们将分离物分成家族级的簇。我们发现基因组群的特征是一个相对大的核心基因组，每个成员中平均有33.6 %的注释蛋白质，每个群中只有一个基因组中识别的单个基因的比例更小( 14.0 % )。对每个集群系统发育多样性的详细分析显示，叶、根和土壤分离物之间存在大量重叠(补充数据5 )。许多簇没有显示出明显的分离基于生态位的分离物，表明它们具有共同的核心功能。然而，其他集群包含一个器官的分离物，或者显示出它们之间的明显分离，这表明在一些集群中存在生态位专业化(补充数据5 )。然后，我们检查了测序分离株之间的功能多样性，以确定观察到的系统发育重叠是否与叶和根分离株之间的功能相似。功能距离的主坐标分析( PCoA ) (图2a；方法)揭示了基于分类的基因组清晰聚类，但仅基于它们的生态区，基因组的有限分离。总的来说，基因组的系统发育和功能多样化都受到其分类学从属关系的强烈驱动，而受到微弱的生态位驱动。
我们检查了每个细菌家族中的功能多样性(图2b )，以识别功能多样性程度不同的细菌分类群。与属于拟杆菌属、厚壁菌属、尤其是变形杆菌属(平均成对距离为0.65 )的家庭相比，属于放线菌属的家庭显示出较低的功能多样性(平均距离为0.37 )，尽管所有家庭级群体都具有相当程度的系统发育相关性，但它们显示出较高程度的家庭内功能多样性。在这些组中，假单胞菌科、草酰杆菌科和甲基杆菌科的成员表现出最高的功能异质性，相比之下，我们认为微生物科是功能多样性最低的科(图2b )
图 2
我们使用富集分析在各个功能类别中寻找生态位特殊化的特征，以识别根、叶或土壤分离物基因组中过度表达的功能类别(图3；方法)。具体而言，我们发现与从根中分离的基因组相比，“碳水化合物代谢”类别在叶和土壤基因组中更丰富( Mann - Whitney试验，P = 1.29×107；图3b )。我们推测，这种差异富集可能反映了根渗出过程中简单碳源(糖、氨基酸、脂肪酸) [21、22]的可用性，而与叶子或未播种土壤相关的细菌可能依赖更多样的碳水化合物代谢基因来获取稀缺资源和复杂的有机碳，例如多糖和叶子表皮蜡。与从叶子中分离出来的基因组相比，“异种生物的生物降解和分解代谢”类别在根基因组中更丰富( P = 2.60×10 - 11；图3b )，这与先前芳香化合物利用基因在根际[23]中表达的证据一致。没有一个分类单元对这些显著差异负责，但是这似乎是各个生态位的测序细菌基因组的一个普遍特征(扩展数据图5和6 )。有趣的是，我们观察到，与它们各自的未播种土壤对照相比，欧亚种葡萄根宏基因组样本18中功能类别的差异丰度趋势相同(扩展数据图7 )。
图 3
总之，这些发现表明拟南芥叶和根来源的培养物集合的基因组中功能能力有很大的重叠，并且在单个功能类别的水平上存在差异，这可能反映了叶和根微生物群各自生态位的特殊化。小生境定植的额外基因组特征可能隐藏在目前没有功能注释的基因中(约57 % ）。
4 无菌植物的合成群落定植
我们用合成群落( SynComs )对无菌拟南芥植物进行定植，合成群落由我们培养物集合中的细菌分离物组成，以评估它们在含有煅烧粘土作为惰性土壤替代品的定植系统中的宿主定植潜力(方法)。为了模拟自然环境中叶和根微生物群的分类多样性，我们主要采用了两种融合体:“L”由218种叶源性细菌组成，“R+S”由188种成员组成，其中158种是根源性细菌，30种是土壤源性细菌(补充数据6 )。输入Syncoms或者在将表面消毒种子播种在煅烧粘土中之前直接接种，和/或喷雾接种在三周龄无菌植物的叶子上。对于所有定义的社区，我们检查了三种独立的Syncom制剂，每种制剂都在三个装有四种植物的封闭容器中进行测试。我们采用了16S rRNA基因群落特征分析，采用了一种针对特定群落验证的方法24来检测7周大的根、叶或未播种粘土样本中输入和输出同步体之间的潜在群落转移。在这个社区分析中，“指示器OTUs”或者代表一个菌株，或者代表一组已知的菌株(补充数据6 )。
在将输入R+S SynCom应用于粘土(“粘土中的R+S”)并与拟南芥植物共培养7周后，我们从粘土(无宿主)、根和叶隔中检索出可再生的R+S输出群落(补充图2 )。与输入R + S SynCom中的放线菌、拟杆菌和厚壁菌相比，这些输出SyncM曲线对变形杆菌RA降低75 %具有稳健性(输入比率分别为1 : 1 : 1 : 1 : 1或1 : 1 : 0.25 )，
这由PCoA证实(图4a )。PCoA还在三个测试隔间的每一个中显示了不同的输出社区(图4a；P<0.001扩展数据图8a，b )。这表明粘土中发生了显著的独立于宿主的群落变化(没有宿主)，以及特定于叶子和根的依赖于宿主的群落变化。接下来，我们通过在三周生植物的叶子上喷雾接种来测试叶子来源细菌的“L”交叉。“L”SynCom与植物共孵育四周后，在叶子和根中检测到输出群落(补充图3 )。PCoA揭示了这两个输出群体之间的差异，但是对输入蛋白细菌RA减少75 %有很强的抵抗力(图4b；补充图3；p < 0.001；扩展数据图8c，d )。尽管输入同步的RAs各不相同，但趋同的输出社区表明，这些社区已经达到了稳定状态。这些实验还揭示了R+S和L SynCom成员不仅定居同源宿主器官，而且能够异位定居叶和根，这可能与自然环境中拟南芥叶和根微生物群的广泛物种重叠有关(图1a，b )。此外，这为叶子定植细菌的子集来源于未播种的土壤的假设提供了实验支持，并增加了在各个微生物群建立期间和/或之后，根和叶子之间发生相互细菌定植事件的可能性，例如，根细菌从根向上迁移到叶子25。在施用Syncoms叶面喷雾时，少量的叶细菌可能会降落在粘土表面，然后定居在根部，这与自然环境中发生的过程没有根本不同，例如在阵雨和/或叶子开裂时。
图 4
对所有根和叶来源的分离物的指示Outs和在环境根和叶样品中识别的相应Outs之间的等级丰度分布进行比较，揭示了在门、类和家族级别的相似趋势(扩展数据图9 )。这验证了gnotobiotic植物系统作为微生物重建实验的工具。
5 同步微生物生态位特异性微生物群的建立
根和叶微生物群及其相应的培养物集合之间的物种重叠(图1a，b；扩展数据图4 )促使我们测试R+S和L同步体是否同样有助于根和叶微生物群的建立。将两种融合体与表面灭菌的拟南芥种子一起汇集并接种在粘土中(图5a中称为“粘土中的RSL”)。我们还测试了预先形成的根相关社区是否会干扰叶相关社区的建立。经过三周的共培养后，用添加了15个根源菌株(命名为“粘土中的RSL & L + 15R喷雾”)的L SynCom通过叶面喷雾接种处理了一半生长有“粘土中的RSL”SyncM的植物。经过四周的共同培养，确定了植物器官特定的输出群体。我们还将L SynCom单独接种在粘土中，并确定了输出SynCom (图5a中标记为“L在粘土中”)。
我们发现“粘土中的RSL”和“粘土中的RS”实验的叶相关输出群落之间存在显著差异(图5b；P<0.001，扩展数据图8f；补充图2和4 )，并且'L在粘土中’接种后叶片上的输出群落类似于RSL在粘土接种中’的叶片输出(图5b；P<0.001，扩展数据图8f；补充图4和图5 )，表明在这一比较中，来自叶的SynCom比来自根和土壤的细菌对叶微生物群结构的影响更大。然而，“RSL倾斜”和“L在粘土中”的叶子输出与“L喷雾”实验的叶子输出显著不同(图5b；P<0.001，扩展数据图8e；补充图3 - 5 )，显示许多来自叶子的分离物仅在粘土环境中接种时不能成功定居叶子。例如，在排名前16位的gen[1]era，与“粘土中的RSL & L + 15R喷雾”实验相比，“粘土中的RSL”的叶子输出中总共有三个严重不足( 金黄杆菌属、鞘氨醇单胞菌和变异杆菌；补充图6 )和这三个属在天然叶微生物群中丰富(扩展数据图4 )。最后，在“粘土中的RSL & L + 15R喷雾”和“仅L喷雾”实验之间，叶子的产量惊人地相似(图5b；补充图3和7 )表明，在将RSL施用到粘土上三周后喷雾接种的L+15R SynCom可以替代RSL的叶子产量。总的来说，这些结果支持了这样的假设，即叶子微生物群的建立受益于空气和土壤传播的接种[8，17]，尽管我们注意到我们对叶子的单一细菌应用并不模拟自然界中植物叶子不断暴露于空气传播的微生物。
上述实验的根相关群落输出的比较显示，“粘土中的RSL”实验比“粘土中的L”实验更类似于“粘土中的RS”的根输出(图5c；P<0.001扩展数据图8g )，表明根和土壤来源的SynCom对根微生物群结构的影响比叶来源的SynCom更大。在这个实验中，根特异性指标OTUs的分数贡献在输出中增加，但是相对于它们的输入，叶特异性指标OTUs的分数贡献减少，这表明根衍生细菌对根定植的潜在适应性(扩展数据图10a曼-惠特尼；p < 0.05 )。观察到，在“粘土中的RSL”实验中，当在至少一个生物复制品中应用0.1 %的相对丰度阈值(分别为69 %和33 % )时，根特异性指示剂OTUs的根定植率高于叶特异性指示剂OTUs。总的来说，这表明根源细菌比叶源细菌更适合于定居它们的同源宿主生态位。“粘土中的L”和“L喷雾”实验的根相关输出群落的进一步比较(图5c；补充图3和图5 )显示了相似的群落组成，表明异位根相关群落输出的收敛，尽管接种时间点或施用地点不同。使用'R’(仅根菌株) SynCom的额外的相互移植实验或者应用于粘土(“粘土中的R”)或者通过喷雾接种(“R喷雾”)证实了叶上根源细菌的异位群落输出的收敛性(扩展数据图10 b，c；补充图8和9 )。异位SynCom输出的收敛与叶和根定植细菌的子集有可能在叶和根之间重新定位的假设一致。
图 5
结 论
通过系统的细菌分离方法，我们建立了拟南芥叶和根相关微生物群可拓展的培养集，这些微生物群包含，其在各自的自然群落中可重复发现的大多数物种(≥0.1 %相对丰度)。测序的细菌基因组以及任何未来的更新都可以在http://www.at-sphere.com获得。这些资源加上诺托生物重建系统的显著再现性，使得今后能够在实验室条件下对细菌群落的建立和功能进行研究。
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