科研 | J. Am. Coll. Cardiol.：血管疾病中的细胞外基质
编译：Donna，编辑：小白、江舜尧。
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细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）是细胞周围由多种大分子组成的复杂网络，主要由5类物质组成，即胶原蛋白、非胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖与氨基聚糖，可分隔中、大动脉血管壁中膜中沿圆周排列的血管平滑肌细胞层，是血管壁的重要组成部分之一。此外，ECM含有大量信号分子，这些信号分子参与调控细胞的生长、极性、形状、迁移和代谢活动。该篇文章是JACC焦点论坛的第2部分（共4部分），主要讨论了ECM对血管稳态与病理的贡献，阐述了ECM在一系列血管疾病如动脉瘤、动脉硬化、动脉粥样硬化等中的重要作用。随着遗传学和蛋白质组学方法的发展，研究人员对ECM有了更深层次的发现，如何将这些发现转化为临床疾病生物标记物和潜在的未来治疗方法是本论坛讨论的重点。
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内容
1.1 弹性蛋白（Elastin）
弹性蛋白是血管弹性纤维的主要组成部分，由疏水单体（Tropoelastins）的多聚和交联形成。在主动脉中，弹性蛋白主要由内侧VSMCs产生，用来平衡作用在大型导管上的机械力，从而允许弹性反冲，产生反复收缩和舒张周期。在成熟的弹性纤维中，弹性蛋白核心被微原纤维包围。而微原纤维主要由原纤蛋白和微纤相关糖蛋白组成。研究发现弹性蛋白基因缺失会导致VSMCs过度增殖，从而引起小鼠主动脉梗。这种VSMCs的过度生长提示弹性蛋白在正常情况下会抑制VSMCs的增殖。缺乏弹性蛋白的杂合小鼠仍能存活，但会表现出高血压，主动脉顺应性下降，弹性薄层变薄等情况。在脊椎动物中，随着封闭循环系统的发展，弹性蛋白可能沉积在微原纤维上，形成弹性纤维网络和弹性薄片，从而为脉动血流提供具有更高压力的机械特性。
1.2 胶原（Collagen）
强纤维胶原与弹性蛋白相连排列形成长交联纤维，提供动脉硬度（指收缩时使血管壁变形所需的力）和血管壁强度（在血管壁失效前可施加到血管壁的最大力）。胶原形成一个具有独特组成的精细ECM网络。胶原蛋白中三个独立的多肽α链相互缠绕形成三重螺旋，除此之外，胶原蛋白还含有非三重螺旋结构域，这些非三重螺旋结构域被用作其他ECM蛋白的连接位点。这些结构域有不同长度的重复基序，可以实现不同的排列从而形成其他超分子聚合体。这种结构的异质性导致了功能的多样性。这些超分子进一步组装可形成特定的基质大分子，如纤连蛋白、蛋白聚糖、细胞表面结合素等。
弹性大动脉中的胶原主要是纤维胶原（I、III、V型）、网状型胶原（IV型胶原）和珠状丝型胶原（VI型胶原），主动脉中的胶原主要是I型和III型，虽然III型在中层更为丰富，但I型是外膜的主要形式。在小鼠模型中，I型、III型和V型胶原的突变会引起血管破裂从而导致小鼠过早死亡。Small leucine-richpro-teoglycans（SLRPs）支持胶原纤维的形成，SLRPs的敲除模型证实异常的胶原纤维发生会导致ECM脆性。
IV型胶原和 VI型胶原位于基底膜以及VSMCs周围不完整的基膜层中。在机械需求增加的情况下，IV型胶原会用于维持基底膜的完整性及其正常的生理功能。基底膜增厚是高血糖引起的早期糖尿病微血管病变的特征之一。VI型胶原也参与基底膜的组装，主要与血管的发育相关。在小鼠中缺乏VI型胶原会减少血管基底膜的组装从而引起血管渗漏。
1.3 蛋白聚糖（Proteoglycans）
除了胶原蛋白和弹性蛋白，蛋白聚糖也有助于血管壁的机械特性。蛋白聚糖由表面有糖胺聚糖（GAG）侧链修饰的蛋白核心组成。蛋白聚糖定位于基底膜或细胞膜。血管壁的高弹性也称为动脉粘度，在很大程度上是由透明质酸蛋白聚糖的聚集物提供。然而，动脉粘度并没有像动脉的顺应性、扩张性和刚度等其他机械特性那样得到全面的评估。多功能蛋白聚糖（Versican）是血管壁中主要的蛋白聚糖，在血管损伤后会它的表达会增加，并在晚期动脉粥样硬化斑块中积累。负责蛋白聚糖周转的主要蛋白酶是去整合蛋白和解聚蛋白样金属酶蛋白（ADAMTSs）。ADAMTSs的清除和保留之间的平衡是维持血管完整性的关键，这种平衡由细胞表面受体调控，包括低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1）。在动脉粥样硬化和动脉瘤的形成过程中，ADAMTSs越来越被认为是蛋白聚糖周转的重要调节因子。如在灌注血管紧张素II的小鼠模型中，ADAMTS-5活性丧失会导致主动脉扩张和血压升高等。
图1 动脉壁的组成和血管ECM成分
由ECM提供的机械或粘弹特性由3个主要成分决定：弹性纤维、纤颤胶原和蛋白聚糖。内皮细胞、VSMCs和高度连接这两者的ECM网络，它们的机械化对血管壁的内稳态至关重要。年龄的增长、粘弹性的改变以及由高血压引起的机械应力的改变，都会导致血管ECM组成的改变。
2. ECM重构、动脉硬化和动脉粥样硬化
ECM的降解和重构是一系列血管疾病如高血压、动脉硬化、动脉瘤形成和动脉粥样硬化的重要标志。
2.1 高血压和动脉硬化
动脉硬化是在临床上最早发现有不良血管重构表现的血管疾病（见图2），与高血压的动脉壁退行性硬化有关。动脉硬化与动脉粥样硬化不能混淆，前者是指血管弹性小，而后者是说由血管内脂质斑块引起的血管硬化。多普勒超声心动图法的PWV测定可以重复测量弹性特性（见图2）。在高血压发病过程中的动脉硬化和ECM重构与胶原的代谢密切相关。例如，自发性高血压大鼠的肠系膜小动脉和原发性高血压患者的皮下抵抗动脉中胶原含量会增加。
动脉壁的重塑主要是由胶原酶或金属蛋白酶（MMPs）诱导的。Pollanen等研究发现，MMP9启动子的多态性会导致蛋白酶的高表达，从而引起大动脉中更大的硬化以及过度激活的MMP9活性。其他研究发现，PWV和组织抑制物金属蛋白酶（TIMPs）与MMPs的比值、前胶原蛋白表达的增加之间存在正相关，表明ECM降解的增加具有代偿性反应。显微镜下，硬化血管表现出胶原沉积、MMP表达增加、碎片化和弹性蛋白减少、内皮细胞紊乱以及巨噬细胞和单核细胞浸润等。
2.2 动脉粥样硬化
遗传因素在动脉粥样硬化的发生中起主要的作用。跨大西洋冠状动脉疾病全基因组复制和荟萃分析联盟利用全基因组关联研究，确定了遗传变异和冠状动脉疾病之间的关系。发现的风险位点包括ECM和基底膜基因，主要是胶原IV（COL4A/COL4A2)、整合素亚基- 5（ITGB5）和纤维连接蛋白（FN1）。有趣的是，ITGB5-FN1相互作用使细胞锚定在ECM上从而实现抗凋亡作用，强调了细胞-细胞外基质连接在血管疾病中的重要性。COL4A2的变异与COL4A1和COL4A2的表达、VSMC存活、ECM重塑和动脉粥样硬化斑块稳定性密切相关。因此，基底膜蛋白的改变可能是影响冠状动脉疾病发展的关键细胞事件。此外，基因突变影响MMPs表达也与动脉硬化和动脉粥样硬化病变的进展也有关。
根据反应-保留假说，含有胆固醇的脂蛋白颗粒与内膜蛋白聚糖的结合是动脉粥样硬化发生的主要致病过程。脂蛋白一旦被保留，就会被氧化积聚在“泡沫细胞”中，引发一系列炎症过程，推动动脉粥样硬化过程。总的来说，versican和biglycan都可保留低密度脂蛋白，从而导致脂质沉积在内膜下间隙以及随后的动脉粥样硬化。当在动脉粥样硬化早期，正常动脉中versican聚集易导致脂蛋白潴留。因此，影响versican表达的致动脉粥样硬化刺激可能促进斑块的发展。而biglycan同样也与脂蛋白的保留有关。然而，与预期相反，biglycan的缺乏加速ApoE-/-小鼠的动脉粥样硬化过程，而不是减缓。但是，ApoE-/- biglycan -/-小鼠主动脉病变形成与蛋白聚糖aggrecan的显著增加有关。
Versican是动脉壁中主要的透明质酸结合蛋白多糖，aggrecan是在关节软骨中发现的，主要由血管壁损伤诱导产生。根据来自人类血管系统的蛋白质组学数据，与动脉相比，aggrecan在静脉中的表达较低。然而，在静脉移植病的小鼠模型中，aggrecan在被移植到动脉血液循环中的静脉中表达。而在人类的曲张静脉中可以观察到aggrecan的丢失。这些数据证明了ECM及其相关蛋白在动脉粥样硬化疾病的发生和进展中发挥着重要作用。
图2 病变动脉中改变ECM的影响概览图
病变动脉与健康动脉相比，VSMCs从收缩型转变为合成表型，aggrecan/versican型蛋白聚糖的积累导致ECM更加水化，以维持血管壁黏度，增强的蛋白水解可导致弹性蛋白的碎裂。弹性的丧失或机械应力的增加可以通过增强的胶原交联来补偿，而胶原交联有助于动脉硬化。
3 ECM和主动脉瘤
3.1 主动脉瘤的病理机制：从内侧变性到基质诱导的细胞因子信号缺陷
胸腹主动脉瘤（TAAs）患者主动脉病变的组织病理学特征为中层变性，表现为弹性纤维碎裂、胶原纤维紊乱、蛋白聚糖聚集、VSMCs丢失以及收缩合成表型转换。一般认为，VSMCs是TAAs发生过程中的重要部分，除导致较低的收缩性和更容易发生细胞凋亡外，还可以导致内侧ECM异常。在正常主动脉中，VSMCs通过严格控制分泌MMPs及其抑制剂（TIMPs）来维持ECM稳态。然而，MMPs分泌过多致使TAAs动脉壁的ECM不成比例的降解。这种显著的ECM恶化将导致参与信号通路调节ECM稳态的细胞因子释放。
3.2 动脉瘤疾病继发于结构性ECM缺乏
3.2.1 胶原蛋白的改变是引起主动脉瘤的一个重要原因
研究表明，一些胶原编码基因（即COL1A1、COL1A2、COL3A1和COL5A1)的基因缺陷与主动脉瘤的发展有关。如95%以上的血管性皮肤弹性过度综合征患者中发现COL3A1突变；COL5A1的突变通常导致典型的埃勒斯-丹洛斯综合征，并引起关节过度伸展和萎缩疤痕；COL1A1和COL1A2的突变是成骨不全症的常见原因。
3.2.2 弹性蛋白在主动脉瘤中的作用
弹性蛋白编码基因（ELN）的显性突变导致皮肤松弛症（ADCL），表现为皮肤无弹性和松弛。而删除ELN的突变会导致主动脉瓣上狭窄。30%至50%的ADCL患者同时患有TAAs。弹性蛋白的功能获得会加剧TAAs的发生，但其具体机制还有待研究。
3.2.3 纤维蛋白和主动脉疾病
富含半胱氨酸的糖蛋白纤颤蛋白1（FBN1）和纤颤蛋白2（FBN2）是微纤颤支架的主要结构（即弹性纤维的另一主要成分）。FBN1和FBN2基因的显性突变分别导致马凡氏综合征（MFS）和先天性蜘蛛状挛缩综合征（CCA）。
3.2.4 其他基质蛋白和胸主动脉瘤
TAAs也可引起蛋白聚糖、纤维蛋白和微纤颤相关蛋白（MFAP）等家族发生突变。在TAAs内侧退变中，aggrecan和versican主要聚集在VSMCs中，从而增加血管内肿胀压力，破坏细胞- ECM的相互作用以及主动脉壁微结构。
纤维蛋白是进化中高度保守的ECM蛋白，与基底膜和弹性纤维有关。到目前为止，在所有已报道的有助于弹性生成的纤维蛋白中，纤维蛋白4和纤维蛋白5是最重要和非冗余的。在人类主动脉中，纤维蛋白5的表达水平远高于纤维蛋白4，但主动脉病仅在携带突变纤维蛋白4编码基因（FBLN4）的患者中出现。研究者推测这种现象的出现是因为纤维蛋白4在维持血管壁胶原的完整性方面起着非冗余的作用，而纤维蛋白5则没有该作用。
3.2.5 基质修饰酶与主动脉瘤
弹性蛋白和胶原的交联由一个严格调控的酶过程介导，包括修改特定的胶原和弹性蛋白氨基酸残基。原胶原-赖氨酸-2-氧戊二酸-5-双加氧酶（PLOD）在胶原分泌前催化赖氨酸的羟基化。PLOD1缺乏的患者可能会出现动脉瘤、主动脉及中型动脉的剥离。
3.3 动脉瘤疾病继发于细胞因子信号失调
3.3.1 转化生长因子β信号
病理上，TGF-β信号通路的增加涉及到MFS背景下TAAs的发病机制。在患有MFS的小鼠中，研究人员表明当TGF-β信号失调时会导致TAAs的发展，而TGF-β中和抗体的使用可以减缓动脉瘤的发生。在正常生理条件下，含有FBN1的微原纤维严格控制ECM靶向TGF-β配体。FBN1的突变导致MFAP网络的弱化，从而致使TGF-β配体的无限制释放，不成比例地激活下游的TGF-β信号。在另一个临床相似的TAAs综合征中，编码TGF-β通路负调控因子SKI的突变会增加TGF-β信号从而导致TAAs综合征（见图3）。
3.3.2 骨形态发生蛋白信号（BMP）
与TGF-β配体相似，通常认为BMP细胞因子的生物利用度通过ECM中的微纤维调节。虽然已有研究证实TAAs综合征中ECM蛋白缺乏会影响肌肉骨骼系统中BMP信号传导，但是其在主动脉组织中的作用仍待研究。最近还发现BMP信号通路抑制剂SMAD6在二叶主动脉瓣相关TAAs中功能丧失（见图3）。
图3 ECM成分与TGF-β、BMP信号通路之间的联系简图
ECM为我们的身体器官提供结构支持，并隔离生长因子。随着ECM完整性和强度的丧失，组织隔离作用可能会变弱，导致生长因子的失控释放。
4. 血管ECM的蛋白质组学
目前ECM的研究方法局限于集中研究病理生理学中的个体因素，其生物学功能还未全面了解。考虑到ECM蛋白网络的复杂性与连通性，单个成分的基因突变将导致次生重塑过程，可能阻碍血管的机械特性。仅仅知道某些ECM蛋白的突变影响并不能全面认识ECM重塑。引用新的蛋白质组学方法（如一种表征VSMCs的蛋白质组学方法）可更系统全面地分析细胞外蛋白，目前这种方法已经广泛应用于研究血管重构。其他ECM蛋白质组学方法将特定蛋白酶的活性与ECM降解产物联系起来并识别新的蛋白酶靶点已经用于分析VSMCs和内皮细胞分泌蛋白的工作流程。最新的糖蛋白组学技术可以对血管疾病中ECM蛋白糖基化变化进行研究，这是一个未被探索的血管生物学领域，这些研究为ECM蛋白在血管疾病中的作用研究奠定了基础。
讨论
ECM是血管壁的重要组成部分。ECM蛋白的变化在多个血管疾病中普遍存在，从高血压到动脉瘤到动脉粥样硬化，甚至罕见的血管疾病（见图4）。在许多情况下，这些变化已被证明是相关血管疾病的潜在诱因。遗传学和蛋白质组学方法的发展促进了研究人员理解ECM在生命周期中的重要作用。目前研究人员已经了解ECM稳态改变和基质诱导的细胞因子信号转导紊乱在TAAs、高血压、动脉粥样硬化等疾病中的作用。随着研究的不断深入，这些知识将被应用到疾病生物标记物的发现中，甚至用于发现治疗这些疾病的新方法。
图4 ECM在纤维肌肉发育不良中的作用
(A)以导管为基础的血管造影图像显示了影响肾动脉的多灶性纤维肌肉发育不良（FMD）的典型外观，即串珠状外观（箭头）；(B)受FMD影响的动脉横切面。左为弹性蛋白染色，右为苏木精染色。可见中膜外有致密的纤维结缔组织，VSMCs排列紊乱，胶原沉积；(C)和(D)使用抗磷酸酶和肌动蛋白调节剂1（PHACTR1抗体）免疫染色正常和纤维肌异常的颈内动脉，检测内皮细胞和VSMCs中PHACTR1的表达。这些图像突出了FMD导致血管结构和VSMCs排列紊乱。