到底剖宫不剖宫？研究表明剖宫产或顺产对早产婴儿肠道菌群的纵向发展没有显著差异
一、导读
最近，榆林产妇跳楼事件再一次将人们的视线拉向顺产和剖宫产的问题。在出生过程中，婴儿会接触到大量活菌。而如今，有大量实验表明菌群与多种疾病的发展有关。虽然已有证据证实胎龄和喂养等因素会影响早产儿菌群结构[1-3]，但是有关剖宫产和顺产对早产儿肠道菌群动态变化的研究仍然比较缺乏。
随着人们对菌群研究的深入，有新证据显示婴儿在出生前就有可能接触到微生物，但是菌群的定植还是主要发生在出生过程中的，因此婴儿的出生方式会影响从母亲传递到子代的菌群结构的形成。先前有关足月婴儿的研究发现，在出生后24h内，顺产足月婴儿体内的微生物主要来源于母亲阴道（主要是乳酸杆菌），而剖宫产足月婴儿体内的微生物主要是来源于母亲皮肤（主要是葡萄球菌）[4]。在出生后的几天和几周内，定植在婴儿身体不同位点的菌群开始出现更大的差异[5]。但是，也有研究发现，剖宫产和顺产对菌群的整体组成或特定菌群的丰度无显著差异。
基于以上，本研究使用已有的数据库[6,7]和所得结果来直接探讨这两种不同的出生方式对早产儿在新生儿加护病房（NICU）时的肠道菌群和出院后的肠道菌群随时间的动态变化。
二、论文ID
原名：Cesarean or Vaginal Birth Does Not Impact the Longitudinal Development of the Gut Microbiome in a Cohort of Exclusively Preterm Infants
译名：剖宫产或顺产对早产儿肠道菌群纵向发展的作用没有显著差异
期刊：Frontiers in Microbiology
IF：4.076
发表时间：2017年6月6日
通讯作者：Christopher J. Stewart
通讯单位：贝勒医学院
三、试验方案
注：①由于2013年NICU操作的改变，新生儿还将会接受益腹宁胶囊（Infloran；双歧杆菌和乳酸杆菌）的治疗。本试验中，21个剖宫产婴儿里有4个接受了益生菌的处理。但是在后续的菌群分析中，通过生物信息手段，将益生菌及其他重要的协变量进行了相应的调整。
②46个早产儿的特征如表1所示
表1 46个早产儿（包括剖宫产和顺产）的特征
*质控和稀释后剩余的样品数
NICU，新生儿加护病房；NEC，坏死性小肠结肠炎；LOS，晚发败血症
四、结果
1、剖宫产与顺产婴儿菌群α和β多样性分析
婴儿出生后，所观察到的样品OTUs数量先呈下降趋势，但是从12日龄到100日龄的过程中，OTUs的数量从11个增加到17个。虽然顺产婴儿粪便样品有较多的OTUs，但是两种出生方式对OTUs的作用无显著差异（经过曼-惠特尼横向分析比较，每周P值都大于或等于0.43）（图1A）。此外，Shannon多样性从婴儿刚出生时约0.75增加到NICU出院时的1.25，但两种出生方式对Shannon多样性的作用无显著差异（经过曼-惠特尼横向分析比较，每周P值都大于或等于0.49）（图1B）。婴儿出院后，所观察到的OTUs及Shannon多样性继续增加，但两种出生方式对出院后婴儿的粪便样品的作用也没有显著差异（OTUs P =0.212；Shannon P =0.428）（补充数据图2A,B）。同样地，剖宫产和顺产对婴儿在NICU（图1C,D）和出院后样品的weightedUniFrac及unweighted UniFrac距离的作用也无明显不同（weighted UniFrac P = 1；unweighted UniFrac P = 0.875）（补充数据图2C,D）。通过比较在第1、3、5、8周时weighted UniFrac距离也发现，剖腹产和顺产对其有相似的作用（补充数据图3）。
图1 出生方式对菌群α和β多样性的纵向发展。没有对出院后的样品进行分析。阴影区域表示95%的置信区间。（A）OTUs，（B）Shannon多样性，（C）基于连续样本的Weighted UniFrac，（D）基于连续样本的Unweighted UniFrac
补充数据图2 盒式图显示了不同出生模式的早产儿出院后α多样性、β多样性和OTU的追踪结果。出院后的婴儿粪便样品数较少（剖宫产n=6，顺产n=10），从而阻碍了稳健统计比较
补充数据图3 剖宫产及顺产婴儿Weighted UniFrac PCoA比较。每个时间点只包含任意一个给定的单个样本以避免重复测定。（A）第一周，（B）第三周，（C）第五周，（D）第八周，（E）出院后
2、顺产婴儿菌群OTU具有较好的稳定性，但无论是在NICU还是出院后，两种出生方式对OTU数量的影响都没有显著差异
对连续样本的OTU进行追踪，发现与剖宫产婴儿样品相比，顺产婴儿样品从产后第二个月开始有更多的OTUs（P < 0.001）（图 2A）。而在第一个月时，所维持的OTUs（OTUs Kept）数量在剖腹产和顺产早产儿中并无明显差异（P = 0.947）。从婴儿出生后到第四周期间，消失的OTUs（OTUs lost）和新获得的OTUs（new OTUs gained）数量下降，但是重新获得的OTUs（OTUs regained，之前在婴儿粪便样品中检测到的OTUs）数量增加（图2）。然而两种不同的出生方式对前100天肠道菌群消失的OTUs（OTUs lost）、重新获得的OTUs（OTUs regained）或新获得的OTUs（new OTUs gained）的作用均无明显不同。对出院后的菌群进行分析，发现与剖宫产相比，顺产婴儿维持的OTUs（OTUs Kept）数量（相对于NICU最后的样品）继续显著增加（P = 0.021）（补充数据图2E）。但是，剖宫产或是顺产对消失的OTUs（OTUs lost）、重新获得的OTUs（OTUs regained）或新获得的OTUs（new OTUs gained）的影响均无显著差异（补充数据图2F-H）。
图2 两种出生方式对早产儿肠道微生物OTU的纵向跟踪分析。没有对出院后的样品分析。阴影区域表示95%的置信区间。（A）维持的OTUs，（B）消失的OTUs，（C）重新获得的OTUs（之前在婴儿粪便样品中检测到的OTUs），（D）新获得的OTUs（之前在婴儿粪便样品中未检测到）
3、顺产和剖宫产对早产儿肠道菌属的作用无显著差异
克雷白氏杆菌（Klebsiella，在NICU样本中总体相对丰度为28%），埃希氏杆菌（Escherichia,22%），肠球菌（Enterococcus,15%），葡萄球菌（Staphylococcus,14%）和双歧杆菌（Bifidobacterium，5%）在NICU样品中占主要地位且在前100天占总相对丰度的84%（图3）。Klebsiella和Enterococcus的丰度在NICU期间维持相对稳定，Staphylococcus和Escherichia的丰度从出生后就开始下降，而Bifidobacterium丰度呈逐渐增加的趋势。为了确定在NICU期间菌属相对丰度的差异显著性，研究人员采用横向方法进行分析。结果发现剖宫产和顺产对任何时间点的任何菌属的丰度的影响均无显著差异（补充数据表1）。而在所有NICU样品中，拟杆菌是丰度第八高的菌（补充数据图4），但在出院后样品中，拟杆菌是丰度第三高的菌（补充数据图5）。对出院后菌群的比较也发现，两种出生方式对主要菌属相对丰度的作用是相似的（补充数据图5）。
图3 不同出生方式对主要菌群纵向发展的作用。NICU样品中丰度最高的5个菌群占总相对丰度的84%。每个点代表一个样品。阴影区域表示95%的置信区间
补充数据表1 调整协变量后丰度最高的菌属的多变量线性回归与FDR校正后的P值
线性回归模型调整了年龄、性别、出生体重、孕龄、坏死性小肠结肠炎和/或晚发性败血症的诊断、接收母乳、抗生素等因素。模型中只包括在>10%样品中丰度>0.1%的菌群
补充数据图4 NICU样品中拟杆菌相对丰度随时间的变化
补充数据图5 盒式图表明在出院后，婴儿肠道菌群丰度最高的十种菌。出院后的婴儿粪便样品数较少（剖宫产n=6，顺产n=10），从而阻碍了稳健统计比较
4、两种出生方式对早产儿菌群分型的作用无显著差异
使用基于weighted UniFrac的KK-中心点算法（也称PAM算法）聚类，可将早产儿的肠道微生物组划分为6个不同的类型，称之为早产儿肠道菌群类型（preterm gut community types, PGCTs）（图4A）。除了PGCT1和PGCT 4以外，其他PGCTs的Shannon多样性都有显著差异。此外，PGCT 2和PGCT 4的Shannon多样性较高而PGCT 6（葡萄球菌为优势菌）的Shannon多样性最低（图4B）。在早产儿出生后的初始阶段，不同的出生方式可在一定程度上造成PGCTs的不同（图4C,D）。其中最明显的是第一周时剖宫产婴儿样品的PGCT 3较多，而顺产婴儿样品的PGCT 4较多。第三周时，顺产婴儿PGCT 4继续增加，但第5周之后，两种出生方式对PGCTs的影响是相似的。尽管PGCTs的发展有这样的趋势，但是肠道微生物的生长轨道在婴儿体内和婴儿之间是高度变化的，而剖宫产和顺产并不会造成PGCTs的显著差异（P = 0.125）（补充数据图6）。
图4 NICU样品中早产儿肠道菌群类型（preterm gut community types, PGCTs）。基于weighted UniFrac的PGCT聚类。（A）盒状图显示6个PGCT中差异最显著的8个菌属。***表示P < 0.001。（B）盒状图显示PGCT的Shannon多样性。不同的小写字母表示差异显著。（C,D）PGCT过渡模型显示了剖宫产（C）和顺产（D）婴儿在出生后前8周时4个不同时间点PGCT的变化。点和边缘的大小意味着相对应的PGCT的数目
补充数据图6 每个婴儿的PGCTs生长轨道。包含所有NICU样品。PGCT聚类是基于weighted UuniFrac的
5、两种出生方式对所预测的菌群代谢潜力的作用是相似的
使用Tax4Fun来推测不同出生方式下婴儿肠道菌群的代谢潜力。使用FishTaco来确定在每个时间点（第1、3、5、8周及出院后）所推测的代谢功能的差异显著性。结果发现，在这些时间点剖宫产和顺产并不会造成通路的明显差异。
五、结论
与已发表的有关足月婴儿的研究结果不同，在此研究中，科研人员发现剖腹产和顺产对早产婴儿肠道菌群的多样性、组成、特定菌属或整体菌群的发展的影响均无显著差异。这可能是由于早产儿出生后在NICU中立即使用抗生素和/或缺少拟杆菌在早产儿体内定植造成的。因为在足月婴儿的研究中发现剖宫产和顺产主要会显著影响拟杆菌。
六、点评
虽然目前关于剖宫产和顺产对子代菌群影响的研究已有不少，但是有关剖宫产和顺产对早产儿肠道菌群动态变化的研究仍然缺乏。本研究通过分别采集早产儿在NICU中和出院后的粪便样品，结合多种分析方法发现两种不同的出生方式对早产婴儿肠道菌群的作用是相似的。
然而，本研究具有一定的局限性。首先，收集的NICU样品均来自一个单位，如果可以收集多个不同NICU中的婴儿粪便样品，可能会发现一些相关性。其次，出院后，婴儿的粪便样品收集起来相对困难，本研究只收集到了35%的出院后样品。再次，本研究中婴儿抗生素的广泛使用使得研究人员无法直接分析出生方式对菌群的影响。最后，本研究仅分析了16S rRNA，后续研究中还可利用蛋白质组学和代谢组学来进一步深度探究。
参考文献
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