血小板功能检测进展及临床应用
作者：丛玉隆 李祖兰 来源：检验世界网
自2002年卫生部文件建议“废除Duke法检测出血时间、玻片法检测凝血时间，建议应用PT、APTT替代作为术前出血筛查”以来，凝血试验检测在国内发展迅速，使用凝血仪器的档次在国际上也处于很高的水平，但在临床应用上距离国际水平还相差太远。我们现在所说的凝血检测在绝大部分医院中指的仅仅是凝血四项，或再加D二聚体检测。实际上，凝血因子检查远远不止这些。以我科开展的项目为例，凝血因子检查大约有几十项。另一方面，血栓的形成与血管、血小板、凝（抗凝）血因子、血液粘稠度等因素都有重要的联系，特别是血小板功能的变化。血小板功能的检测在临床上有很大的作用，而目前国内在血小板功能的检测项目的开展没有得到应有的重视，原因是实验室的临床服务意识、实验室知识结构、方法学质量控制等因素限制了血小板功能检测在国内的开展。
进入二十一世纪，人类社会的老年时代也随之而来。人口老龄化带来的社会问题是疾病谱发生变化。建国初期我国死亡率最高的疾病是传染病，之后为肿瘤；而进入二十一世纪，随着人口老龄化的出现，心脑血管疾病逐渐上升为死亡率最高的疾病，成为人类健康的第一杀手。其中，心脑血管疾病多半的机制都是血栓的形成，如因冠状动脉形成血栓导致的冠心病、脑血管、脑血栓等等都是由血栓引起的。同时，形成血栓的核心因素及第一要素就是血小板。
当前，年龄大于50岁以上的老年人，由于血管内皮细胞、血脂等的变化易患心脑血管疾病，很多老年人都在服用阿司匹林治疗，那么阿司匹林服用剂量应该为多少合适呢。剂量过小不会获得治疗效果，而剂量过大则容易导致血小板功能的过分抑制，导致自发性出血。但是目前80%-90%的医院对服用阿司匹林后血小板功能监测项目开展的很少，大大影响了临床对心脑血管疾病的诊断和治疗。
凝血过程及血小板形成血栓的病理生理基础
正常情况下，血液每天都在血管内流动，为机体输送氧气，进行气体交换、新陈代谢、抗炎等，而不会出现血栓的现象。但一旦出现问题时，血管内就会有血栓的形成，对受损部位进行止血。机体既能保证血液正常流动又不会凝固，而出现问题时又马上止血的原因是正常生命活动中，机体内存在一种非常复杂的而又统一对立的生理调节系统即抗凝系统和凝血系统。抗凝系统和促凝系统在神经和神经体液调节下处于动态平衡，可保证血液中的红细胞、白细胞、血小板等物质处于正常作用，保证血管的完整性，保持血液呈液体状态，既不出血，也不形成血栓。图1为血管内示意图。
血小板功能检测进展及临床应用
在凝血系统中形成凝血抗凝对立统一系统的机制来源于血管特别是血管壁、血小板和血浆中的各种相关因子（如图2所示）。其中血管壁包括血管壁的变化、血管壁的结构、血管壁的内皮细胞壁释放出的因子（促凝时释放促凝因子，抗凝时释放抗凝因子）。
血小板功能检测进展及临床应用
正常情况下机体以血管作为平台、以血管内皮细胞为总指挥调节血小板的功能，调节血浆中的各种因子变化，始终保持机体平衡。血小板和血管内皮细胞均具有双重作用。出血时，促凝系统发挥作用，血管内皮细胞首先暴露胶原蛋白，胶原随后激活血小板，使血小板粘附、聚集并释放凝血因子，这些凝血因子再激活其他一些相关因子，最后导致纤维蛋白原变为纤维蛋白，形成血栓进行止血。一旦止血成功后，血管修复了，就不再需要这些栓子，此时血管内皮细胞就释放纤溶因子，促使纤溶酶原变为纤溶酶，溶解纤维蛋白。如图3所示。
血小板功能检测进展及临床应用
血小板在血栓形成的作用
血小板结构
血小板结构决定血小板功能。正常的血小板形状不规则，无细胞核但有细胞器，是巨核细胞胞浆液剥落下来的脱离细胞。细胞中含有内质网、微管微丝、高尔基体、线粒体、致密颗粒等结构，其中较为特殊的、与血小板凝血作用紧密相关的结构是致密颗粒，含有很多的凝血因子(如ADP、ATP)。见图4。血小板处于正常静止状态时，致密颗粒不会起到抗凝作用；而当血小板一旦被活化后，致密颗粒、α颗粒收缩释放各种物质，然后这些物质通过血小板内的通道进入到血小板外部的血浆内，并与血浆中的凝血因子相互作用，促进凝血过程。
血小板功能检测进展及临床应用
激活后血小板功能
血小板被激活后的功能主要有：粘附，血小板附着在某物体的表面；聚集，血小板相互间的粘附；变形，血小板形态变化，白色血栓形成；释放，释放血小板内容物，加强凝血因子、血小板、内皮细胞功能。其中，血小板这些功能的实现主要依赖的是血小板表面上的各种受体（见图6），如与胶原结合的糖蛋白1、与粘附作用有关的糖蛋白Ⅰb、与聚集作用有关糖蛋白Ⅱb/Ⅲa、凝血酶的受体糖蛋白Ⅴ。受体被激活后，血小板内部会发生一系列的生理变化以及更加复杂的化学变化，如图5、图6所示，构成了血栓形成的病理生理基础。
血小板功能检测的的临床应用
（一）血小板病的实验诊断
（二）血栓前状态的实验诊断
（三）抗血小板药物治疗监测
血小板检查项目
（一） 一般检查： 1.血小板计数; 2. MPV; 3. 血块回缩试验。
（二） 血小板功能检查： 1. 血小板粘附试验; 2. 血小板聚集试验; 3. 血小板粘附集聚试验; 4. 血栓弹力图。
其中血小板聚集试验方法有：(1)血小板集聚仪法； (2) VerifyNow仪法； (3)流式细胞术聚集法; (4)血小板粘附聚集试验用到的仪器为PF-100 血小板粘附集聚仪。
（三）特殊检查：
1. 血小板释放物包括致密颗粒的释放（如血小板ATP释放，5-TH测定）和α颗粒释放（如PF4，β-TG，GMp-140）检查;
2. 血小板AA代谢（如TXB2，丙二醛）检查;
3. 血小板膜蛋白（如GP I，GP IIb和IIIa）;
4. 血小板内钙流、钙波动检测。
上述试验项目中最适合临床常规诊治工作是血小板聚集试验，各项血小板聚集试验的方法学原理大致是相同的，血小板聚集原理见图-7。
血小板功能检测进展及临床应用
血小板表明有很多的受体和糖蛋白，其中比较重要的是糖蛋白IIb/IIIa。正常情况下这两种糖蛋白以分开、游离形式存在。以ADP或AA受体为例，一旦在血浆中加入ADP或AA，它们就变为诱导剂，跟血小板ADP或AA受体结合反应，促使GP IIb与GP IIIa结合在一起形成GP IIb/IIIa结合物。之后，GP IIb/IIIa结合物与血浆中的纤维蛋白原结合，在一定钙浓度情况下，血小板与血小板之间粘附、聚集、变形，形成血小板血栓。如图8所示，血小板聚集试验获得成功需要注意的要素有血小板浓度（血小板聚集的关键因素），相对应受体的存在与否，诱导剂的质量和浓度，钙浓度（由抗凝剂加入量决定）等等。当前血小板聚集试验最大问题就是对这些要素缺乏标准化的质量控制。
血小板集聚仪工作原理
血小板集聚仪工作原理主要有两种，浊度法和电阻法。浊度法是在富含血小板血浆（PRP）中加入致聚剂，血小板发生聚集，血浆浊度变化，透光度增加，将血小板聚集仪这种浊度变化转换为电信号并记录，形成血小板聚集曲线。根据血小板聚集曲线可了解血小板聚集的程度和速度。电阻法（阻抗法）是根据电阻抗原理，通过放大、记录浸泡在全血样品中电极探针间的微小电流或阻抗的变化来测定全血样品血小板聚集性的方法（如图8所示）。
血小板功能检测进展及临床应用
PFA-100?血小板检测仪
PFA-100?是一款检测血小板粘附聚集比较标准化的血小板检测仪，早在上世纪90年代在国外就已进入临床使用，笔者在本世纪初曾进行过方法学评价并做了一些科研课题，但其在国内并没有得到应用。其优势和缺点都很突出。优势是操作快速，简便，易于质量控制；单一试剂包；已有不少的相关文献发表。缺点是试剂价格昂贵；易受受vWF, PCT, HCT，PLT等参数的影响；只有两种试剂包（ADP、胶原），应用范围窄。图9为该仪器的工作原理图。
血小板功能检测进展及临床应用
流式细胞技术可检测血小板表面的抗原，可区分激活状态和非激活状态的血小板，激活状态标志物CD62/P-Selectin。但是该方法所用仪器和试剂都比较昂贵，操作复杂，需受过特别培训的技术人员。因此，该方法不能作为快速检测项目。其检测结果见图11所示。
血小板功能检测进展及临床应用
VerifyNow 抗血小板治疗监测系统
VerifyNow 抗血小板治疗监测系统操作流程如图12所示。该仪器目前在国内仅限于科研所用，其优点包括：（1）快速，3分钟内出结果；样本采集后只需等10钟的样本稳定期；有AA、ADP、GPⅡb/Ⅲa三个受体检查试剂盒；（2）简便，全血样本—无需样本预处理；无需专业培训的操作人员；全自动操作，包括取样、厂家定标准确；无需让病人停药检测基础值也能准确得出血小板抑制百分比。但是，该仪器费用昂贵。
血小板功能检测进展及临床应用
血栓弹力图监测血小板功能
血栓弹力图是对血小板功能动态变化的描述，对血小板功能的监测并不具备特异性，而且成本费用极其昂贵，目前多用于术中作为快速检查，判断血液凝血系统的变化，以决定输血治疗的方案。
比浊法血小板聚集仪方法学评价
从上述的各类仪器的方法学比较可以看出比浊法血小板聚集仪最适我国使用，但检验结果的不稳定性限制了它的普及，如果比浊法血小板集聚试验实行标准化、规范化操作，检验结果能否反映血小板功能变化？比浊法血小板集聚试验能否作为首选的常规试验？为了回答这个困扰多年的临床实际问题，笔者做了如下研究：研究对象为健康成年人例，每天服用100mg阿司匹林，连续服用三天后停药。分别在服药前、服药后、开始停药、停药后2天、4天、6天、8天、10天从研究对象中抽血检测血小板聚集率，所得结果如图13所示。
血小板功能检测进展及临床应用
出现这种结果的原因是血小板在体内的生命周期是9-10天，刚开始服用阿司匹林时，100%的血小板都被抑制，停药后，每隔一天都有十分之一的血小板衰亡，并有十分之一的血小板生成，而新生成的血小板并没有受到药物的抑制作用。停药后10天，受到药物抑制的血小板全部衰亡，所以血小板聚集率恢复到服药前的血小板聚集率。此外，作者采用流式法、放免法检测到的血小板聚集率变化图线几乎与图13中的曲线重合，证明了血小板聚集实验方法的可行性。但需建立严格的质量管理措施。
影响血小板聚集的各种因素及质量控制
血小板聚集试验要达到标准化会受到很多因素的影响（如图14所示）。
血小板功能检测进展及临床应用
血小板浓度：反应的血小板数最少为15万才能完成血小板聚集试验。
血浆PH变化：未经特殊处理的静脉血标本放置时间过长，可影响血浆PH,直接影响检测结果。
抗凝剂种类：采用不同的抗凝剂所得结果是不一样的，标准的抗凝剂是枸橼酸钠。
抗凝剂用量：正常红细胞比积血液与抗凝剂剂量比例必须为1:9，抗凝剂的多少直接关系到血浆游离钙的含量。如果抗凝剂用量过大，会导致血浆内钙浓度偏低，无法完成凝集。但当Hct过低（<20%)、过高（70%）,抗凝剂用量要做相应调整。
PFR保存的条件和时间
血小板聚集仪工作状态：试验中最容易忽略的是反应杯的透光度，其次对结果有影响的易忽略的还有搅拌棒的质量和 标准化程度。
另外，聚集剂种类、浓度、剂量与保存及患者试验前服用抗凝药物干扰都是引起试验误差的常见因素
对各种影响血小板聚集试验因素的研究
（一）PRP血小板浓度对AA、ADP诱导血小板聚集影响
如表1所示，采用300万或400万AA、ADP诱导血小板聚集时，血小板浓度必须至少在180万或150万以上才能出现血小板聚集。需要注意的是该研究采用的是血浆，与采用全血所得结果不同。
（二）标本的保存时间对血小板聚集率的影响
标本取出后必须加塞保存，否则血浆中CO2扩散影响PRP的pH值。或者标本存在5%CO2和95%空气混合气体环境中。此时，贮存时间与标本PH的变化对血小板聚集率的影响。
（三）时间、温度对ADP诱导血小板聚集率的影响
标本放置温度对ADP诱导血小板聚集率有明显的影响，标本放置时间和温度之间存在交互效应（P<0.05）。34℃组血小板聚集率最低，4℃组血小板聚集率最高。
血小板功能检测进展及临床应用
注：AA、ADP诱导血小板聚集都受Ca2 明显影响。血浆Ca2 浓度在0.04～0.11mmol/L时，血小板聚集率随钙离子浓度的增高而增高。