你真的用Image J测到了WB条带灰度值吗？

关于用Image J量化westernblot条带灰度值，在网上一直盛传着两种操作方法，然鹅～小伙伴们却一直不确定到底哪种才是正确的测量灰度方法，甚至将灰度与光密度弄混淆。今天咱们一起就这个机会学习下，请先看看你是用以下那种方法测量灰度值？以下是两种方法的具体操作。

方法一

1、打开Image J软件→左上角file→Open 选择自己的条带图片(事先把条带摆正)

2、把图片转化成灰度图片：Image→type→8-bit

3、第一个矩形工具→选上所有条带

4、analyze→Gels→select first lane→Gels→plot lanes（在这第四步也可以分开选取，如：框选第一个条带→analyze→Gels→select firstlane→将第一个框拖移到余下条带→Gels→select nextlane）

5、选中直线工具，将开口波峰关闭

6、选中魔棒工具（正数第七个），点击波峰，就得出所有area值。

方法二

1、打开Image J软件→左上角file→Open 选择自己的条带图片(事先把条带弄正)

2、把图片转化成灰度图片：Image→type→8-bit

3、扣除背景：Process→Subtract Background→50pixels 并勾选Light Background

5、设定参数：Analyze→set measurement→勾选Area、Mean gray value、Min & max gray value、Integrated density

6、Analyze→set scale→unit of length选项里改为pixels，确定

6、图像分割。Edit→Invert→选中椭圆圈（手残党首选）/不规则圆圈（心灵手巧党义无反顾），手动圈上单个条带

7、Analyze→Measurement即得到Intden,重复6、7步就得到所有Intden值

小伙伴们，你们是哪种方法呢？首先先把结论说出来，其实两者得出的area和Intden严格来说都不是灰度值，前者是面积而后者是光密度值，但用来量化WB条带都是OK的。

Image J这个软件在将western blot条带量化时存在两种参数：灰度与光密度（假，暂且这么称呼，原因下文再说），这两者在理解使用Image J量化WB条带十分重要，请务必仔细看以下几个概念。

1、灰度(gray)：是指图像中各种颜色的深浅程度, 它以整数值表示, 一般的图像分析软件将图像每个像素点的颜色分为 0-255共 256 级，每一像素点对应的数值即灰度，灰度值越小物体颜色越深。有兴趣的小伙伴，可以随意用Image J打开一张图片，光标在图片上任意移动，得到的value值最小为0（纯黑），最大为255（纯白）。

2、光密度(OD，真)：也就是吸光度（A）, 光线通过溶液或某一物质前的入射光强度Io与该光线通过溶液或物质后的出射光强度Ib比值的对数OD=lg（Io/Ib），其实就是大家熟悉的分光光度法的朗伯比尔定律。

明确这两个概念后，我们再来看为什么称Image J里的光密度是“假”，因为在图像分析中的光密度（假）是由灰度值再经计算得到的, 它是一个相对值, 但其算法与 OD 值的算法类似。只是它的入射光强度由Western blot胶片上最亮区域的平均灰度值代替, 而出射光强度则由待测目标平均灰度值代替。即:图像分析系统的光密度值=lg(WB胶片上最亮区域的平均灰度值/ 待测目标的平均灰度值)，再简单点来说，就是光密度（假）和正儿八经的灰度值有血缘关系。

总结起来说灰度与光密度（假）都能用来量化western blot条带，两种量化任君随意挑。

现在说回两种操作方法：

方法一：

是通过每个条带上众多像素点对应的灰度值勾画出一条曲线，最后魔棒点出算出的area值其实就是该条带所对应的面积大小。条带越大，area值越大。

方法二：

是通过上文说到的光密度（假）计算方法得出来的，最后得出的Intden值是所圈面积下的总光密度值，再除以圈下面积area，得出的是平均光密度值（图像中阳性区域每一像素点的 OD 值叠加后除以测量的面积）。条带（颜色反转后）越白越亮则Intden/area越大。

所以严格意义上来说，方法一方法二最后得出的数据都不属于正儿八经的灰度值，但又与灰度值有着千丝万缕的联系。如果只是量化WB条带，两种方法是都能选用的，记得标注你得到的结果是area还是Intden，但如果你想测出真正的灰度值，那么我们下节课再来好好谈谈，咦？我说话怎么越来越像老师的风格呢，哈哈，同学们，下课！

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