科研 | mSystems：多组学方法揭示食用发酵食品与肠道微生物组和代谢组的系统性差异相关
编译：小鹿同学，编辑：小菌菌、江舜尧。
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生活习惯（如饮食）强烈地影响微生物组的结构、多样性和组成。尽管过去几年人们对发酵食品愈发感兴趣，但还没有任何研究专门在大规模人群中探讨发酵食品的食用对肠道菌群的影响。
论文ID
原名：Consumption of Fermented Foods Is Associated with Systematic Differences in the Gut Microbiome and Metabolome
译名：发酵食品的消费与肠道微生物组和代谢组的系统差异有关
期刊：mSystems
IF：6.519
时间：2020.3.17
通讯作者：Muriel Derrien & Rob Knight
通讯作者单位：法国达能营养研究中心&加利福尼亚大学圣地亚哥分校医学院儿科
实验设计
本研究首先从美国肠道计划（AGP）中筛选了参与者，根据食用发酵植物的频率将参与者分为消费者和非消费者，并进行了人口学评估和饮食评估；接着，研究者对参与者的粪便样品进行16S rRNA基因测序分析，比较了发酵植物消费者和非消费者肠道微生物组的组成；另一方面，研究者另外在AGP中招募了115名参与者进行了为期4周的纵向研究，使用非靶向高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）和16S rRNA扩增子测序以及宏基因组测序等多组学方法对肠道菌群的纵向稳定性和功能进行了探究；最后，研究者使用mmvec整合了宏基因组和质谱的数据，以评估基因组特征（物种）与亚油酸（LA）和共轭亚油酸（CLA）代谢物之间的共现模式。
结果
1. 发酵植物消费者与非消费者的人口学和饮食评估
为了探索发酵食品消费者和非消费者之间肠道微生物组的差异，研究者分析了来自美国肠道计划（AGP）中21,464个人的28,114个样本的16S rRNA测序数据（图1a）。数据经过筛选后保留了6,811个样本，被称为横向队列（图1a）。研究者在最初招募用来同时进行纵向评估的参与者中，选择其中115名进行详细讨论。根据参与者记录的食用发酵植物的频率，将其认定为“消费者”或“非消费者”。每个参与者都回答了标准AGP调查表中的发酵植物频率问题，尽管这种方式可能没有涵盖所有的发酵食品，但这是描述消费者和非消费者的最有效方法。研究者认为消费者是指“每天”、“定期（每周3至5次）”或“偶尔（每周1至2次）”食用发酵植物的消费者，非消费者是指“很少（每周少于一次）”或“从不”食用发酵植物的消费者（图1b）。30.5％的参与者被认定为消费者，其中大多数消费者（45.3％）属于偶尔食用发酵植物。消费者和非消费者队列由略有不同的人口统计学群体组成。例如，虽然消费者的年龄要比非消费者年轻一些，但差异不大（分别为47岁vs 47.61岁），且30多岁年龄段的参与者比例更高（23.0％vs 19.4％；卡方检验=11.08，P =0.03）（图1b）。同样，消费者组具有稍微较高的女性比例（56.8％vs 52.6％；卡方检验=9.60，P =0.002），身体质量指数（BMI）在18.5~25之间的参与者比例更高（65.6％vs 59.3％；卡方检验=35.93，P <<0.001），消费者与非消费者的平均BMI分别为23.9和24.8。消费者还报告吃了更多种类的植物（>20种）（29.7％vs 24.5％；卡方检验=126.96，P <<0.001）。此外，由于酒精可能是发酵过程的终产物，其可能是与肠道菌群变异相关的混杂因素，因此研究者验证了酒精摄入与食用发酵植物无关（81.7％vs 82.6％，卡方检验为=0.76，P=0.38）。
图1.队列情况概述、样本筛选和元数据探究。（a）数据筛选过程和通过16S rRNA基因测序、代谢组学和鸟枪法宏基因组学分析的样本数量以及横向队列和纵向队列中样本的最终数量。（b）消费者和非消费者在横向队列中一些元数据类别（人口统计学和饮食）的分布。深色代表消费者；浅色代表非消费者。消费者组和非消费者组根据“发酵植物频率”调查表进行定义。
根据食品频率调查表（FFQ）的估计，发酵植物消费者和非消费者的平均总碳水化合物和脂肪摄入量（克/天和能量百分比）以及蛋白质能量的百分比具有统计学上的显著差异，而总能量（卡路里/天）、膳食纤维（克/天）和蛋白质（克/天）的摄入量没有差异。尽管消费者和非消费者之间食用发酵植物和植物类型的数量存在差异，但根据健康饮食指标的评估（HEI-2010; Mann-Whitney U= 223409，P=0.094），他们的总体饮食质量没有显著差异；消费者和非消费者在HEI-2010评分中的这种不显著差异（分别为71.29 vs 71.53）表明，类似的饮食模式在饮食质量方面相对较高。应该注意的是，根据2011-2012年美国国家健康与营养调查（NHANES）的数据，消费者和非消费者的HEI-2010平均总得分均高于18~64岁美国成年人的全国平均水平（58.27）。这表明本文研究人群的饮食方式比普通美国人的饮食方式更符合《美国人膳食指南》。此外，研究表明较高的HEI得分与较高的收入和教育水平相关，从而表明在AGP队列中观察到的较高HEI总得分可能反映出先前已观察到的高于平均水平的社会经济地位和教育水平。
2 发酵植物消费者和非消费者的肠道微生物组组成
通过对未加权的UniFrac分析，研究者观察到消费者和非消费者在整体肠道微生物群落方面具有统计学上的显著差异（方差的置换多元分析（PERMANOVA）伪-F-统计量=3.677，P=0.001）。非消费者与消费者的偶尔食用组比较时会导致群体分离（F-统计量=2.233，P= 0.001），但这种群体分离比定期食用组或每日食用组的要弱（F-统计量分别为3.512和3.246；P= 0.001），这表明肠道微生物组中发酵植物的食用频率存在剂量依赖性。但是，消费者与非消费者之间植物种类的频率没有剂量依赖性（消费者与非消费者的未加权UniFrac分析与植物种类的频率数之比，R2= 0.0065）。两组之间的α多样性没有差异（Faith的系统发育多样性（PD）、Shannon多样性、操作分类单元（OTU）的丰富度均未观察到差异），并且当各组按照食用频率分层时也没有观察到差异。
接下来，我们使用Songbird来鉴定与消费者或非消费者相关的特定微生物。Songbird是一种组分感知差异丰度的方法，其以感兴趣协变量的对数倍变化为基础，对特征（次操作分类单元[sOTU]）进行排列。在这种情况下，研究者使用公式来描述了受试者是否食用了发酵植物。研究者选择了与发酵植物食用相关的排名最高的20个sOTUs和排名最低的20个sOTUs，并使用Qurro来计算这些分类集合的对数比率。用这种方法比较分类单元的比率可以减少每个样品中未知总微生物量的偏差，取该比率的对数可以同等的权衡分类单元的相对增加和相对减少。相对于基准模型对食用发酵植物的Songbird模型进行评估，得出的Q2值为5.4249，这表明合理的过度拟合与发酵植物食用组之间差异的微妙性相关。为了验证Songbird等级选择的对数比率，研究者进行了置换检验，该检验对1000个对数比率进行随机排列，并在分子和分母中具有20个非重叠特征。与随机排列相比，等级次序为16，对应的P=0.0159，这表明基于Songbird等级的对数比率是非随机性的。研究者发现，与非消费者相比，消费者的第一组与第二组具有显著更高的对数比率（t检验，P =0.00065，t =3.6367），这表明它们与拟杆菌属、假单胞菌属、Dorea菌属、毛螺旋菌属、普氏菌属、Alistipes putredinis、颤螺菌属、肠杆菌科、梭杆菌属、放线菌属、无色杆菌属、梭状梭菌、柔嫩梭菌、单形拟杆菌、梭菌目和代尔夫特菌属相关。
3 频繁和极少食用发酵产品的消费者中肠道微生物组的组成
研究者招募了115名参与者进行纵向研究，从而能够随着时间推移，通过非靶向质谱和16SrRNA测序技术以更精细的分辨率来评估肠道微生物组。研究者以那些频繁食用或极少食用的参与者为评估目标。使用与横向队列中相同的定义来鉴定消费者：消费者指“每天”、“定期（每周3至5次）或“偶尔（每周1至2次）”食用发酵植物的人群；非消费者指“很少（每周少于一次）或从来没有”吃过发酵植物的人群。纵向队列旨在与横向队列相比，使“每日”和“定期”相对于“偶尔”食用发酵植物的消费者比例更高。同样，纵向队列的非消费人群中“从不”和“很少”食用发酵产品的参与者比例要高于横向研究中的非消费人群。
研究者向这115名参与者提供了单独的发酵食品调查表，以表征其它类型发酵食品的食用，并评估了发酵植物消费与一般发酵食品消费之间的关系。简要来说，食用的主要发酵食品是啤酒、泡菜、康普茶、酱菜、酸菜和酸奶。与非消费者相比，有更多消费者记录了食用过发酵食品。只有7.0％的参与者（8/115）表示他们从未食用过发酵植物，但他们报告称食用了另一种发酵食品。在这八名参与者中，有两名报告称他们喝了葡萄酒或啤酒；有一名参与者称食用了酸奶、苹果酒、葡萄酒和啤酒；五名参与者称食用了未详细说明的发酵食品。研究者还观察到，与非消费者相比，发酵植物消费者更经常食用发酵乳制品（酸奶、酸奶酪/鲜奶油、奶克菲尔和农家干酪）。因此，相对于横向队列来说，研究者更加确定他们为“发酵食品消费者”。
在16S数据中，研究者没有观察到消费者和非消费者之间的α多样性（Shannon指数）和Faith系统发育多样性的差异。研究者进一步应用了稀疏主成分分析（其可以明确考虑到纵向部分的因素），但并没有观察到α多样性上的显著差异（Shannon指数，Wilcoxon P=0.20），这表明对于消费者和非消费者而言，在超过4周的时间里微生物组的α多样性是稳定的。
通过鸟枪法宏基因组学对100个样本的子集进行测序，以更好地解析两组之间的分类学差异。首先，研究者证实了发酵食品消费者的肠道菌群是否与发酵食品相关种类有关。根据Marco等人的工作，研究者使用Qurro计算了与发酵食物相关的分类群的对数比，从而与所有样本中均存在的一组分类单元相比（图2b）。研究者的数据集中检测到了8个物种，并计算了其对数比：嗜酸乳杆菌、短乳杆菌、发酵乳杆菌、乳酸链球菌、肠膜明串珠菌、副乾酪乳杆菌、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌（图2a）。研究者发现与非消费者相比，消费者中第3组与第4组的对数比率显著更高（t检验，P=0.0001838，t= 3.9386，Cohen’s D= 0.851），这表明消费者与一些来源于发酵食品的分类群相关。
图2.消费者和非消费者之间肠道宏基因组的系统发育差异和对数比率差异。（a）宏基因组中俘获的系统发育多样性。将适合rep82数据集的物种分类映射到Web of Life数据库的物种分类中（映射了97.8％），从而代表从全部基因组中计算出的系统发育距离。产生共轭亚油酸（CLA）的物种用红色字体表示。用于对数比率计算的数据集使用不透明颜色（内圈）和透明颜色（外圈）标记。第3组由参考文献6中鉴定的微生物组成，第4组包含所有样品中最普遍的微生物（蓝色方块）。第5组和第6组来源于自Songbird（绿色圆圈）。（b）消费者中第3组与第4组的比率显著更高（t检验，P=0.0001838，t =3.9386，Cohen’s D=0.851）。（c）第5组和第6组的比率显著不同（箱形图，t检验，P=0.0024，t =3.15，Cohen’s D=0.692）。
然后，研究者使用Songbird来测试是否存在与消费者或非消费者相关的更广泛的微生物特征。研究者选择了与发酵植物食用相关的40种排名最高的微生物和40种排名最低的微生物，并使用Qurro计算这些分类单元的对数比（图2c）; 这些是最小的功能集，它们在消费者和非消费者之间提供了有意义的差异。同样，参照基线模型对发酵植物食用量的Songbird模型的评估建议过拟合（Q2=0.12），因此研究者通过置换检验进一步验证了Songbird等级选择的对数比率，该检验对1000个对数比率进行随机排列，并在分子和分母中具有20个非重叠特征。与随机排列相比，等级次序为2，对应的P=0.0019，这表明基于Songbird等级的对数比率是非随机的。该分析在物种水平上表明，消费者中第5组与第6组的对数比率显著高于非消费者（t检验，P=0.0024，t=3.15，Cohen’s D=0.692）。
与发酵食品相关的几种微生物也与消费者相关，包括嗜酸乳杆菌、短乳杆菌、马乳酒样乳杆菌、类布氏乳杆菌、瑞士乳杆菌和沙克乳酸杆菌（图2a）。消费者还与其它几种与发酵食品无关的微生物相关，包括停乳链球菌亚种、产黑色普雷沃菌、Enorma massiliensis、Prevotella multiformis、盲肠肠球菌和Bacteroides paurosaccharolyticus。横向和纵向数据集中可以区分消费者和非消费者的微生物可能不会完全重叠，因为纵向队列有意由更“极端”的参与者组成（“每日”和“定期”食用发酵植物的个体vs.“从来没有”食用过发酵植物的个体），或因为两个队列使用了不同的测序方法（16S vs.宏基因组学），抑或因为这些方面的结合。
4 肠道微生物组的功能特性因食用发酵食品而异
为了评估特意招募的发酵食品消费者和非消费者中肠道微生物组的功能特性，研究者对所有纵向样品（115个受试者，417个样品，每个受试者最多收集4个样品，收集了4周）进行了非靶向HPLC-MS/MS分析（图1a）。研究者使用16S和质谱数据研究了纵向队列的稳定性，发现在消费者和非消费者的采样时间点之间，分类群和代谢物保持稳定（Spearman’s rho：0.42~0.68；P<0.001）。代谢物的相关系数倾向低于分类群的相关系数，这表明所观察到的代谢特征具有更大的波动性。这也是可以预料到的，因为代谢组在很大程度上受饮食的影响，而饮食每天都在变化。
使用偏最小二乘法判别分析（PLS-DA），研究者发现当考虑所有时间点时，消费者和非消费者之间存在显著差异（图3a）。最主要的区别特征似乎是脂质，其中一些具有广泛的自然分布，因此很可能十分常见。特别是，将一种化合物鉴定为十八碳二烯酸，然后具体确定为共轭亚油酸（CLA）的异构体。在单个时间点上，研究者发现这种CLA的异构体（称为“ CLA4”；确切的构型尚不清楚）在消费者中富集（Wilcoxon测试，P=0.04），而未共轭的亚油酸（LA）在两组之间则没有显著差异（Wilcoxon检验，P=0.52）（图3b）。由于CLA已被认为是食用大量发酵植物的受试者样本的区别特征之一，这可能暗示着消费者和非消费者之间的差异可以部分地解释为所食用植物种类的数目。但是，在本研究中两个食用植物类型极端组之间的CLA丰度没有显著差异：食用少于10种植物vs. 食用30种以上植物（Wilcoxon秩和检验，P=0.98）。从食物频率调查表中研究者发现，消费者和非消费者之间总LA和总CLA的饮食消耗没有显著差异，这表明消费者粪便样品中CLA的水平升高可能来自一个内生过程或源于微生物。
图3.消费者中共轭亚油酸的含量明显高于非消费者。（a）非靶向质谱数据的偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）将CLA鉴定为一个区别发酵食品消费者样品的特征。（b）MS1的Zero-centered计数以消费者和非消费者之间的CLA异构体（称为“CLA4”）和非共轭亚油酸（LA）标注。“CLA4”在消费者组中富集（Wilcoxon测试，P=0.04），而LA并没有这种现象（Wilcoxon检验，P=0.52）。使用mmvec对宏基因组学和质谱数据进行综合分析。基因组特征（点）根据其相对于发酵食品消费的变化强度进行标记（红色与食用相关，蓝色与非食用相关）。代谢物用箭头表示，表明它们与基因组共存。
本研究使用宏基因组测序和质谱法共分析了79个样品（图1a）。研究者使用mmvec整合了这些数据，以评估基因组特征（物种）与LA和CLA代谢物之间的共现模式。研究者发现“CLA4”（在消费者中大量富集）常与同消费者最相关的物种（先前使用Songbird鉴定）同时出现。此外，研究者发现亚油酸（LA）与同非消费者关系最密切的微生物共存（图3c）。与“CLA”共现可能性最高的前50个分类群中，有14个是已知的CLA生产者。它们包括直肠真杆菌、Faecalibacteriumprausnitzii、Eubacteriumsiraeum、Eubacteriumhallii、青春双歧杆菌以及罗氏菌属、Anaerostipes、真杆菌属、瘤胃球菌属和梭菌属。在前50个分类群中，有48个在消费者中的丰度比非消费者中高。
讨论
研究者使用PLS-DA对代谢组学数据进行分析发现，脂类代谢的改变与发酵植物的食用有关，因为大多数最有区别性的代谢物似乎都是脂质。在可以确定的代谢物中，CLA特别值得注意。与非消费者相比，消费者中CLA异构体“CLA4”的丰度显著增加。已知CLA在瘤胃细菌发酵过程中产生，会影响反刍动物肉类和奶制品的脂肪酸组成，而反刍动物是人类CLA的主要饮食来源。由于其可能的健康益处，CLA还经常作为营养补品食用。但是，CLA的粪便恢复与食物中CLA的摄入量并不相关，饮食中CLA的摄入主要来自肉类、全脂乳制品和鸡蛋，这根据食物频率调查表（FFQ）来确定。此外，消费者和非消费者之间总CLA的饮食消耗（克/天）没有差异。因此，CLA可能是由来源于发酵食品的常驻细菌或瞬时细菌产生的。
实际上，以前已经证明与饮食有关的细菌（如乳酸菌、双歧杆菌和丙酸杆菌）会产生CLA。已证明属于毛螺旋菌科和Ruminococcaceae科的肠道细菌可将LA代谢为CLA的前体产物，同时还发现毛螺旋菌科中的两种菌与消费者有关。乳杆菌目包括先前报道的CLA生产者中最大多样性，值得注意的是，在先前鉴定为与发酵食品相关的8个物种中，研究者发现与发酵食品消费者相关的7个物种是生成CLA的乳酸菌种，包括嗜酸乳杆菌、短乳杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、副乾酪乳杆菌、植物乳杆菌和沙克乳酸杆菌。然而，消费者中CLA的增加不能完全归因于发酵食品相关细菌的生产。例如，先前报道的在人类粪便中产生CLA的梭菌目中的某些成员（包括四个Roseburia菌种：R. inulinivorans、R. hominis、R. intestinalis和R. faecis）以及Anaerostipes caccae、Eubacterium ventriosum、Faecalibacterium prausnitzii与非消费者相关，已知这些细菌能够代谢LA。
研究者检测到了先前报道的7种以LA为前体产生CLA的双歧杆菌菌种，包括动物双歧杆菌、长双歧杆菌和短双歧杆菌，由于它们具有CLA生产能力，已被认可用于CLA丰富的商业食品（如酸奶）中。然而，研究者并没有发现它们与发酵食品消费者相关。研究者却发现了其他两个未知的会产生CLA的双歧杆菌（B.aesculapii和B. reuteri）与发酵食品消费者有关，而B. reuteri的增殖实际上在LA前体高浓度的情况下受到抑制。此外，在确定与“CLA4”共现可能性最高的前50个分类群中，只有14个是已知的CLA生产者。将来在更大数据集中对代谢途径的研究，可以使人们鉴定出能够解释消费者中“CLA4”比非消费者中丰度更高的物种。
据作者所知，这是发酵食品（特别是发酵植物）的食用与人体肠道微生物组之间关联性的最大研究，本研究在一个时间点的研究对象有近7,000人且对100多个人在4个星期进行了采样。研究者采用了多组学的方法——16S rRNA测序、鸟枪法宏基因组学和质谱法的结合，同时采用了先进的工具来评估数据。研究者发现，在健康个体中食用发酵植物以及更广泛的发酵食品与微生物组中相当细微的微生物变异有关。虽然该探索性研究为更直接的研究（如随机安慰剂-对照研究）提供了基础，但它也有一些局限性，尤其是根据发酵植物食用的个人记录频率对消费者进行分类。首先，个人记录的饮食信息可能存在误差。其次，尽管本研究的数据表明，发酵植物的食用量可以代替发酵食品的食用量，但并未明确考虑其它食品类型（如发酵乳制品）。此外，这项研究主要限于居住在美国的参与者，他们食用的发酵食品多样性可能低于其他国家的人群；应该将这项研究扩展到更广泛的人群，从而使作者能够获得更多种类的发酵食品以及相关的微生物群落。由于这些因素的综合作用，研究者可能低估了食用发酵食品对肠道微生物组的潜在影响。然而，值得注意的是消费者粪便中乳酸菌（LAB）和发酵食品-来源的微生物的恢复表明，粪便中的数据可用来验证个人记录饮食信息的可靠性。因此，在未来的研究中不仅要评估特定类型食物与微生物组之间的关联，还要评估研究者对特定发酵食品消耗量的检测能力，这将具有重大意义。
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