编译：寒江雪，编辑：景行、江舜尧。
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导读
臭氧（O3）是一种在工业化国家和发展中国家普遍存在的氧化性有毒空气污染物。为了解O3胁迫对海棠的影响并探讨海棠对其防御机制，本研究对海棠进行了O3胁迫下的生理、转录和代谢组学研究。300nL/L O3处理海棠3h，叶片受到明显伤害，叶片中的叶绿素和花青素含量也显著变化，并激活了抗氧化酶活性。海棠磷脂酶A编码基因对O3高度敏感。McWRKY75是一个响应O3胁迫的关键转录因子，其转录水平与类黄酮相关结构基因的转录水平呈正相关，O3还上调了乙烯反应因子。外源茉莉酸甲酯(MeJA)降低了O3对海棠的伤害。在200μmol/L浓度下效果最好，MeJA处理改变了海棠在O3胁迫下的代谢途径。特别是，MeJA激活了海棠的类黄酮代谢途径，从而提高了海棠对O3胁迫的抵抗力。
原名：How does Malus crabapple resist ozone? Transcriptomics and metabolomics analyses
译名：转录组学和代谢组学分析揭示海棠如何抵抗臭氧?
期刊：Ecotoxicology and Environmental Safety
IF：4.872
发表时间：2020年5月
通讯作者：陈学森，王延玲
通讯作者单位：山东农业大学
DOI号：10.1016/j.ecoenv.2020.110832
未喷施MeJA的海棠叶片受到O3的明显伤害，出现黄褐色斑点。随着MeJA浓度的增加，斑点逐渐减少，叶色由绿色变为紫色。O3处理前喷施200μmol/L MeJA的植株叶片呈深紫色（图1）。
图1.茉莉酸甲酯（MeJA）在不同浓度（0、50、100和200μmol /L）下对海棠叶片在O3胁迫下损伤程度的影响。
2 生理生化分析
在O3胁迫前，喷施不同浓度的MeJA显著影响海棠花色苷含量，但对叶绿素（Chl）含量(Chla、Chlb和总Chl)无显著影响。然而，O3处理后Chl含量随着时间的推移而降低。处理24h后，Chla、Chlb和总Chl含量分别比处理前下降了56.27%、25.11%和43.30%（图2A）。花青素含量先增加后降低，在O3处理后12h达到峰值，增加61.72%，然后下降（图2B）。喷施MeJA可缓解O3胁迫引起的Chl降解，并呈剂量依赖性。最有效的MeJA浓度为200μmol /L （图2A）。在此浓度下，海棠幼苗的花色苷含量比未处理提高了55.00%（图2B）。随着O3处理时间越长，超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性先升高后降低，在处理后12h达到峰值，分别比处理前增加62.17%和22.92%（图2C）。在O3胁迫前后，施用MeJA均能提高海棠叶片的SOD和POD活性，200μmol /L浓度处理的效果最好。O3处理12h后，200μmol /L (MeJA)处理的植株与对照相比，SOD活性提高11.07%，POD活性提高30.51%（图2C）。未经O3处理的海棠幼苗喷施MeJA丙二醛含量无显著影响。O3胁迫后，未喷施MeJA的幼苗丙二醛含量显著增加(P<0.05)，而喷施MeJA的幼苗中丙二醛含量减少。100和200μmol /L浓度的MeJA处理的幼苗丙二醛含量没有差异（图2D）。本研究采用双因素方差分析的方法，以确定O3胁迫后的时间和MeJA浓度之间的交互作用是否影响海棠的生理生化特性。发现只有Chla和总Chl含量受其交互作用的影响较大。
图2. O3暴露对海棠幼苗生理特性的影响及茉莉酸甲酯（MeJA）在不同浓度（0、50、100和200 μmol/ L）下的缓解作用。A 叶绿素含量。B 花青素含量。C SOD和POD活性。D 丙二醛含量。
3 转录组测序分析
对样品进行转录组测序分析，样品与参考序列的比值范围为86.38%~91.49%。根据比对结果，对蛋白质编码基因的表达水平进行了分析。以Fc>2和P<0.05为筛选阈值，在第2组和第1组中检测到13814个差异基因（6800个上调，7014个下调），在第3组和第2组中检测到494个差异基因（158个上调，336个下调），两个对比组之间共有316个差异基因（图3A和B）。选择15个差异基因进行qRT-PCR定量实验，以验证转录组测序的准确性。
图3.不同组间差异表达基因（DEG）的聚类分析。第1、2、3组分别为正常生长样本、O3胁迫和MeJA处理后的O3胁迫样本。A 第1组和第2组(左)和第2组和第3组(右)之间有显著差异。B聚类分析。C GO注释分析。第2组和第3组D 聚类分析。E GO注释分析。
4 O3胁迫下差异表达的转录因子
在O3胁迫下，13814个DEG中有463个转录因子（TF），包括WRKY、MYB和bHLH家族成员，以及乙烯响应因子（ERF）。大多数转录因子在O3胁迫下表达上调（表1），表明这些转录因子主要通过正反馈调节来响应O3胁迫。O3胁迫后，编码与胁迫抗性相关的TF，如MYB、bHLH和WRKY的丰度发生了显著变化。WRKY家族中的许多基因在O3胁迫下被表达量发生显著变化。McWRKY75的表达水平与类黄酮生物合成结构基因转录水平呈高度正相关，说明McWRKY75可能通过调节类黄酮代谢参与抗O3胁迫。McWRKY75氨基酸序列与梨的WRKY75和WRKY43分别有100%和83%的同源性。核苷酸序列分析显示McWRKY75含有一个W-box（TTGACT）结构。McERF019(LOC114826627)、McERF109-like(LOC103416010)和其他乙烯（ET）合成相关基因的转录本在对照组中没有检测到，但在O3胁迫后检测到较高的表达水平。McERF019和McERF109-like的核苷酸序列均含有G-box(GCCGCC)，说明ET参与了O3胁迫反应的特异性。这些结果表明，ET在海棠响应O3胁迫中起着重要作用，并通过与其他TF中的G-box相互作用来应答O3信号。
表1. O3胁迫响应相关基因的表达水平
5 响应O3胁迫的机制和途径
利用GO富集对DEG进行分类。在生物学过程功能中，显著富集的功能为气孔开放负调控（GO:1902457）、阴离子通道活性正调节（GO:1901529）、赤霉素生物合成过程正调节（GO:0010372）、麦芽糖代谢过程（GO:0000023），磷脂稳态（GO:0055091）和甘油三酯稳态（GO:0070328）（图3C）。表明O3通过气孔进入植物，并针对保卫细胞信号通路中的阴离子来调节气孔的收缩或关闭。位于信号下游的植物激素转导途径调节基因转录以响应外界刺激，从而影响植物的新陈代谢。磷脂调节途径在抗O3胁迫中也起重要作用。DEG分析表明，15个磷脂酶A（PLA）、9个磷脂酶C（PLC）和6个磷脂酶D（PLD）基因对O3的响应在转录水平上表现出显著差异，其中PLA相关基因的转录水平差异最大。表明O3暴露可引起海棠PLA尤其是PLA1的活化，并证实PLA是响应植物对O3胁迫的重要磷脂酶。这一发现对进一步研究O3胁迫的防御机制具有重要意义。
在细胞组分功能中，显著富集的功能是叶绿体类囊体膜蛋白复合体(GO：0098807)、叶绿体光系统I(GO：0030093)、镁螯合酶复合体(GO：0010007)和内质网膜固有成分(GO：0031227)（图3C）。表明O3损害了植物细胞，ROS在叶绿体中积累，光合作用受到抑制，并诱导了内质网胁迫反应。在分子功能中，显著富集的功能与酶和跨膜转运功能有关，包括过氧化氢脱水酶活性(GO：0047987)、柚皮苷查尔酮合成酶活性(GO：0016210)和烟酰胺酶活性(GO：0008936)（图3C）。表明海棠在接触O3后产生的ROS主要以H2O2的形式存在，H2O2的积累对植物组织造成了伤害。
6 MeJA介导的海棠对O3胁迫的响应
在O3胁迫条件下，对MeJA预处理和未经处理的样品进行DEG表达分析。根据Fc>2和P<0.05的阈值筛选出494个DEG，其中包括158个上调DEG和336个下调DEG（图3A和D），表明MeJA触发了海棠对O3胁迫的负反馈调节。GO分析表明蔗糖生物合成过程（GO:0005986）、蔗糖磷酸合成酶活性（GO:0046524）、次生代谢产物生物合成过程（GO:0044550）等上调，类黄酮生物合成过程（GO:0009813）、生长素分解代谢过程（GO:0009852）和SA分解代谢过程（GO:0046244）下调（图3E）。表明MeJA促进了O3胁迫下海棠组织的能量供应，促进了膜或质膜对有害物质的过滤。这主要依赖于次生代谢，特别是类黄酮代谢和激素级联途径。此外，本研究结果还表明，在O3胁迫下，MeJA处理植物的血红素结合(GO：0020037)和铁结合(GO：0005506)功能的DEG表达上调（图3E）。参与这些功能的基因属于细胞色素P450(CYP450)家族，这意味着MeJA也通过调节细胞色素途径参与解毒。因此，外源MeJA可以控制氧化还原信号通路，降低氧化胁迫反应，使植物能够快速适应环境变化。
7 O3应激和MeJA诱导的代谢差异
在分析差异代谢物之前，研究人员通过PCA分析来检测组内和组内的变异程度。PC1可以解释66.67%的变异，说明O3胁迫后海棠的代谢发生了显著变化。PC2解释了10.52%的变异，这是由于处理误差造成的。同样，在O3胁迫条件下，MeJA预处理和没有处理的样品(PC1)之间的差异可以解释代谢物变化的45.78%，而PC2可以解释总变异的23.69%，这主要是由于个体之间的基因型差异（图2）。为了进一步了解O3对海棠代谢的影响，研究人员利用UPLC-MS/MS平台对726种海棠代谢产物进行了检测。通过多种统计方法分析样本组间代谢物的差异。与正常生长条件相比，O3暴露后的海棠中有142种差异代谢物(115种上调，27种下调)（图4A和B）。对差异代谢物进行KEGG富集分析，有67个差异代谢物注释带102条代谢途径，主要途径是类黄酮生物合成(Ko00941)，其次是苯丙素生物合成(Ko00940)和花青素生物合成(Ko00942)（图4C）。这些结果表明，O3胁迫主要引起次生代谢尤其是类黄酮的生物合成途径的紊乱。如图4A所示，O3胁迫后在MeJA预处理和没有处理的样品组之间进行差异代谢物分析，共得到29个（15个上调和14个下调）差异代谢物（图4A，D），其中20种代谢产物注释到44条代谢途径。最显著富集的途径是蛋白质消化吸收（ko04974）、类黄酮生物合成（ko00941）和氨基酸生物合成（ko01230）（图4E）。这表明MeJA通过影响海棠氨基酸和蛋白质的合成，参与次生代谢途径来介导O3胁迫对海棠的响应。类黄酮生物合成途径在第2组与第1组和第3组与第2组的差异分析中显著富集（图4A和E）。说明类黄酮的生物合成不仅是参与O3胁迫的代谢途径，也是外源MeJA激活的关键途径。
图4. 不同对照组间差异表达代谢物(DEM)的丰度聚类分析。第1、2、3组分别为正常生长样本、O3胁迫和MeJA处理后的O3胁迫样本。A 第1组 VS第2组(左)和第2组 VS第3组(右)之间的显著差异代谢物。第1组和第2组B聚类分析。C KEGG富集分析。第1组和第3组D聚类分析。E KEGG富集分析。
8 基因和代谢物共表达分析
因为类黄酮的生物合成途径显著富集，在第2组与第1组和第3组与第2组的比较中，研究人员分析了两个对照组中与类黄酮生物合成相关的差异基因和差异代谢物之间的相关性。在第2组与第1组差异分析中，检测到40个基因调控11种代谢物。在第3组与第2组中检测到9个基因调节4种代谢物。通过选择Pearson相关系数大于0.8的差异基因和差异代谢物构建相关图。用这些差异基因和差异代谢物来构建海棠对O3防御机制的模型（图5）。
图5.海棠对O3胁迫防御机制的模型。
本研究结果表明300nL/L O3处理海棠幼苗3h，对海棠幼苗有严重的危害。海棠抵御O3胁迫的主要生理防御机制是通过色素含量的变化和抗氧化系统的激活。此外，O3通过气孔诱导形成ROS，ROS主要以H2O2的形式积累在叶绿体中。磷脂酶A是植物体内响应O3激活的主要磷脂酶，它通过催化向下游传递信号。调节O3胁迫反应的关键因子McWRKY75，以及两个O3特异ET因子McERF019和McERF109-like，也在O3胁迫下上调，说明外源MeJA能提高海棠对O3胁迫的抗性，最有效的浓度为200μmol/L。外源MeJA还能促进O3胁迫下海棠中蔗糖的生物合成，直接或间接调节激素信号转导、氨基酸代谢和类黄酮代谢。综上所述，这些过程提高了海棠对O3胁迫的抗性。特别是MeJA激活了海棠类黄酮代谢途径，提高了其对O3胁迫的抗性。
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