编译：Frank，编辑：小菌菌、江舜尧。
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导读
反硝化是许多土壤生态系统氮循环中的重要过程，但对反硝化过程速率与微生物基因型之间的关系了解甚少。基因分型可以确定反硝化细菌的氮氧化物还原酶含量不足，这对于氮限制环境中的反硝化至关重要。本文对美国新罕布什尔州的哈伯德布鲁克实验森林（HBEF）的土壤进行了宏基因组学分析，陡峭的海拔、植被和土壤梯度提供了一个复杂的景观基质，以评估反硝化涉及的基因的发生模式。从两个分水岭的三个海拔高度的三个土壤层中提取DNA。
①宏基因组分析显示，群落中反硝化基因的相对丰度在不同土壤深度之间没有差异，但在海拔区域之间却有所差异，总反硝化reads：高阔叶林>云杉>低阔叶林。
②来自nir的reads非常少，这表明在整个森林景观中完全反硝化并不常见。反硝化特异性reads比例最大的是qnor，其可以将有毒的一氧化氮还原为一氧化二氮。涉及中间反应的反硝化基因的相对富集可能表明环境因素选择部分反硝化过程，而不是完全反硝化过程。
③高阔叶林土壤具有最高的反硝化基因丰度和最大的反硝化速率，表明宏基因组学信息与反硝化过程检测值结果一致。尽管完全反硝化产生的能量很少，但由于酸性土壤条件和HBEF土壤中硝酸盐的利用率低，反硝化细菌群落似乎通过产生特定的反硝化基因来补偿。特别qnor 可以帮助群落应对化学硝化产生的有毒物质一氧化氮。
原名：Using metagenomics to reveal landscape scale patterns of denitrifiers in a montane forest ecosystem
译名：宏基因组学揭示了山地森林生态系统中反硝化细菌的模式
期刊：Soil Biology and Biochemistry
IF：5.29
发表时间：2019.11
通讯作者：James P.Shapleigh
1.研究区域和抽样
研究地点位于美国新罕布什尔州中北部的哈伯德布鲁克实验林（HBEF），为湿润大陆性气候，夏季短而凉爽，冬季长而寒冷。土壤主要是砂壤土质地的排水良好的灰土和始成土。主要植被是北部阔叶林，海拔最高的地块包含红色云杉、香脂冷杉和桦木，在这个海拔统称为云杉。在低海拔森林由糖枫、黄色桦木和美国山毛榉，在高海拔和低海拔分为高阔叶林区和低阔叶林区。①一个是熊溪流域(WS6)，Oi / Oe（新鲜枯落物层/半分解枯落物层)结合层中的土壤pH平均为3.9，两个流域的海拔范围从488到747 m，每个流域的面积约为12公顷，坡度范围为5％至25％。在两个流域的云杉，高阔叶林和低阔叶林的30个采样区分别采集两个土壤样品（3个高程·5个重复样区·2个分水岭），并通过不同的层位进行组合：1）有机Oi / Oe，2）有机/矿物Oa / A， 3）B层顶部的10厘米。收集土壤后，将其过筛，将一部分保存在-20°C，另一部分保存在4°C。
2.DNA提取和测序
DNA提取试剂盒：MoBio PowerSoil DNA Isolation Kit。在2个流域，每个流域3个高程，3个土壤样品，共获得了18个样本。为了进行质量保证/质量控制，从熊溪流域的高阔叶林地区的两个土壤层（Oi / Oe，B层）采集了另外六个样品，总共获取了24个DNA样品。测序中心进行了初始质量保证/质量控制（QA / QC），使用CLC Genomics Workbench 4.0进行了额外的QA / QC，修整低质量的reads和<80 bp的reads。自定义数据集用于识别分配给反硝化基因的reads。数据集由一组手动整理的全长蛋白质序列组成，这些蛋白质序列来自IMG数据库中的已测序基因组。对于功能注释，使用DIAMOND将reads与蛋白质数据集匹配。如果比对区域> 25个氨基酸且同一性> 60％，则将reads定义为来自特定基因。使用基于kmer的方法，通过DIAMOND分析鉴定为来自特定基因的reads与该特定基因的DNA序列数据集进行比较。使用Minhash ver进行宏基因组样本比较和聚类。
4. 16S reads提取和表征
使用基于kmer的方法提取细菌基因组的16S rRNA编码区的reads。Bbduk用于提取reads。
5. 脱氮率和动力学
通过分批缺氧培养，在熊溪流域所有三个海拔的Oa / A和B层土壤样品中非原位测量反硝化作用。N 2、O 2、CO 2、CH 4、H 2、NO和N 2 O的顶空浓度通过自动GC装置进行监测，NO 3 -和NO 2 -使用标准比色方法测定。高分辨率气体动力学用于估算反硝化率和气态产物化学计量。使用最初的60小时计算反硝化率，但是要监测200小时的产物积累。N2O还原酶（N2OR）的诱导效率是根据N2O /（N2O + N2）比率降至1以下之前反硝化的N量估算的。
6. 辅助土壤测量
在培养前后，用pH计测量土壤的pH值。培养后，将瓶子在60℃干燥以确定土壤干重。通过同位素比质谱仪和元素分析仪测定土壤样品中的有机碳和有机氮含量。
7. 环境模型
对数线性模型用于跨实验因子水平的reads丰度差异分析。所有显示reads数据比较得出的数据图都是使用R软件包生成的。它们显示了从六个反硝化基因nap，nar，nirK，cnorB，qnor和nosZ的对数线性模型得出的reads“比率”的置信区间，三个深度分别为Oi / Oe，Oa / A和Min，三个海拔区域是云杉，高阔叶林和低阔叶林。比率是每个基因在每个深度（或海拔）的相对reads频率乘以所有样本的总读段计数的平均值。对于每个基因，使用Tukey的HSD方法对三个深度（或海拔）进行成对比较。基于从宏基因组中提取的16S进行群落水平比较，使用对数的拟泊松模型分析反硝化基因reads数量与土壤参数之间的关系。
1. 细菌群落组成
主坐标分析显示出样品之间的差异很小（图1）。高阔叶林场地的样品相互重叠，不同于低阔叶林和云杉杉的样品。同样，来自B层的样本与Oi / Oe和Oa / A样本是相互重叠的。对16s rRNA进行分类分配表明，在每个样品中，变形菌门和酸杆菌门的成员均占优势（从30％到40％不等）（图2）。放线菌门的成员约为reads的10％。其他门类，例如疣微菌门、浮霉菌和拟杆菌门，约占总数的5％。按海拔高度分组时，前三个菌门没有显着差异（图 2b）。但是，当按土壤深度分组时，具有显着差异（图2a）。例如，在矿物土壤中放线菌门和变形菌门的相对比例较低。
图1.从所有测序reads的相似性比较得出的PCoA图。
图 2. 通过深（A）或海拔（B）从宏基因组中提取的16S reads的分类分配比较，仅显示前三个菌门。
2. 反硝化作用的遗传潜力
通过考虑完整的反硝化途径来分析该样点的反硝化基因的普遍性。为此，将来自周质NO3-还原酶催化亚基（nap），呼吸硝酸盐还原酶（nar），含铜NO2-还原酶（nirK），cd1-型NO2-还原酶（nirS），细胞色素c氧化NO还原酶（cnor），喹诺醇氧化N2O还原酶催化亚基（qnor）和一氧化二氮还原酶（nos）的reads进行组合。在两个流域之间，标准化反硝化reads的总数没有显著差异。实际上，在所有基于reads的比较中，两个分水岭的样本之间没有差异，归一化反硝化reads的总数与土壤深度也没有显著差异。但是，当比较高程时，总的归一化反硝化reads显著不同，即高阔叶林>云杉>低阔叶林。
3.特定基因reads的出现频率分析
来自nap、nar、nirK和qnor的reads比来自nirS、cnor和nosZ的reads更多（图3）。最多的reads被分配给qnor，占所有样品中总反硝化reads的30-40％。分配给nar和nap的读段占总数的15-30％，分配给nirK的reads在10-20％之间。分配给nos的reads永远不超过反硝化读段总量的5％。在所有样本中，nirS的reads 不常见。在不同土壤深度的样品之间nar的reads无差异（图3 A），而 Oi / Oe土层深度的nap的reads显著高于B层水平。当按海拔高度对样品进行分组时，高阔叶林中nap读段的相对丰度要高于云杉或低阔叶林中的相对丰富度。低阔叶林中nar的reads比例也比高阔叶林的低，但云杉中nar的reads的数量与高阔叶林的数量大致相同。nirK、cnor、qnor和nosZ的reads数量不会随土壤深度而变化（图3 A）。但是，在高阔叶林中，nirK、cnor、qnor和nosZ的reads均明显高于低阔叶林中的reads（图3 B）。在高阔叶林中，来自nirK的reads也显著高于云杉样品，并且几乎占编码异化亚硝酸盐还原酶reads的全部。所有24个样本中分配为nirK的reads数大于6000，而nirS仅仅有31个reads。对nosZ的进一步分析发现，当分配给第I类和第II类的reads按深度进行聚类时，在矿物质层和Oi / Oe层样品中，每类的reads所占比例大致相等。相比之下，在Oa / A土壤中，进化枝I的reads比进化枝II的读段更有优势。当按高程聚类分析时，高和低阔叶林样品中的I类和II类reads比例相等，而云杉样品中I类的reads比例明显更高。
图3. 与反硝化相关的特定基因的reads数量比较，按深度（A）或海拔（B）分组。
4. 反硝化基因的分类学
通常，除了nar之外，变形菌门是反硝化基因reads的主要来源。因此，在分类学上进行分配，以更好地解析样本之间的差异（图4，图5）。对于nar，放线菌门是最大的reads来源，其余的则分配给各种变形菌。当nar的reads按土壤深度进行聚类时，在所有样品中分配给放线菌的reads数均相似（图4 A）。随着海拔的降低，放线菌的reads也有所减少，并且这种现象也存在于变形菌门中（图4 B）。分配给nap的最大reads来源是α和β-变形菌；酸杆菌门也是重要的来源，大约占15-20％（图5）。反硝化基因中唯一分配给酸杆菌门的reads来自nap。α-变形菌是nirK和qnor的最大reads来源。nirKreads的数量不会随土壤深度的变化而变化，但在高阔叶林样品中α-变形菌中明显更高，被分配为β或γ-变形菌的reads数具有相似的模式。对于qnor也发现了类似的趋势，此外δ-变形菌也被预测为其reads的来源。同时，这组细菌也被认为是nar reads的来源。可以分配到nosZ的reads数量很少，每个样品只有10-40个。但是，一般而言α-变形细菌是nosZ reads的最大来源。值得注意的是，该reads也被分配给黄杆菌、Chitinophagia和纤维粘网菌。
图4. 将nar reads分配给按深度（A）或高度（B）分组的特定细菌类别。
图5. nap reads分配给特定的细菌类别，按深度（A）或高度（B）分组仅显示了前五类。
5. 反硝化速率和动力学
在培养期间，初始气态产物为N2O（图6）。但长时间的培养最终会产生N2。Oa / A土壤中反硝化速率的中值为0.96 μgN/g土壤/h。当按高程分组时，速率不同，其中高阔叶林>云杉>低阔叶林（图7 A）。谷氨酸作为补充碳源在Oa / A土壤中的变化速率没有显著变化，但导致低阔叶林土壤中的碳增加。 B层土壤速率中位数为 0.11 μgN/g土壤/h，显著比Oa / A土壤中的低。按高程分组时，B层的反硝化速率有所不同，即高阔叶林>低阔叶林。与在Oa / A土壤中一样，在B层中添加谷氨酸反硝化速率没有明显改变。Oa / A土壤中的反硝化速率与土壤碳和土壤氮显著正相关。考虑到碳促进了微生物的活动，当用Oa / A土壤中的单位土壤碳表示速率时，它与土壤中的δ15N含量呈正相关。中间反应物和潜在的反硝化产物显示出与高程相关的模式。例如，低阔叶林区土壤比高阔叶林或云杉区土壤显著积累更多的NO2-（图7 A）。相反，在低阔叶林土壤中NO积累最小，而在高阔叶林土壤中NO积累最大（图7 C）。反硝化产物比率变化很大，但在云杉的土壤中，N2O还原之前产生的氮比高阔叶林和低阔叶林的土壤高（图7 D）。尽管B层的反硝化速率很低，但最值得注意的是，B层平均累积的NO 2 -比OA / A层更多（图7 B）。但是，亚硝酸盐积累并没有使B层积累更多的NO，加入谷氨酸没有明显改变。
图6. 培养过程中产物积累的一个典型示例，用于评估200小时的培养过程中反硝化速率以及CO2、CH4和H2动态。
图7.来自HBEF WS6不同高度的样品脱氮率（A），最大NO2-累积（B），最大NO积累（C）和直到明显诱导N2O还原酶活性的脱氮过程（D）的箱线图。
6. 环境条件的影响
使用对数线性模型确定了反硝化基因reads的丰度与可能的解释性环境变量（NO3-、NH4+、土壤含水量、土壤pH和土壤碳）之间的关系。nap、nirK和nosZ的reads数量仅与NO3-呈正相关。qnor reads的数量与NO3-和土壤碳呈显著正相关。然而，当从变量集合中去除NO3-时，碳不再显著，当去除碳时，NO3-仍然具有明显的作用。这表明碳的模型预测是错误的。相反，nar读段数量与任何土壤参数均无显著关系。
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