科研 | Environment International：基于宏基因组学揭示河口沉淀物中细菌菌群对多环芳香烃的共代谢
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河口沉淀物中细菌菌群扮演着人类污染物的生物修复和能量转化的角色，特别是多环芳香烃（PAHs）。但是目前在PAHs胁迫下微生物之间的协同作用以及相关的代谢特征研究较少。本研究收集了河口沉淀物并加入一种多环芳香烃（芘）进行驯化培养，结果显示在培养后期，甲型和丙型变形菌纲为主要的微生物分类，其中未培养的ZD0117为主要的微生物属（归属于丙型变形菌纲）。基于宏基因组学的功能基因分析显示：关于多环芳香烃降解基因的数量变化与多种代谢途径相关，例如甘油酯降解，氮固定，硫转运系统，三羧酸循环以及卡尔文循环（P<0.01,|ρ|>0.8）。本研究同时从宏基因组中重组了56个基因组（MAGs），主要是甲型和丙型变形菌纲的微生物。进一步，在变形菌纲中的微生物基因组中发现了脱氢酶，一种在芘降解中的关键酶。本研究重组出了未培养微生物的基因组，在这些基因组中发现了芘的协同代谢的基因。通过分析典型的MAGs，重建了关于芘降解的微生物组，全面解析了芘降解微生物组的代谢模式。
论文ID
原名：Metagenomic analysis exhibited the co-metabolism of polycyclic aromatic hydrocarbons by bacterial community from estuarine sediment
译名：基于宏基因组学揭示河口沉淀物中细菌菌群对多环芳香烃的共代谢
期刊：Environment International
IF：7.943
发表时间：2019.5
通信作者：王慧
通信作者单位：汕头大学 理学院 生物系
实验设计
本研究样本河口沉淀物采集于珠江入海口。驯化实验设计：10 g沉淀物加入100 mL的矿物盐培养基中，并加入芘至终浓度100 mg/L，在25℃，150 rpm条件下培养30天，对照组为不添加芘。取样点为1，2，3，6，12，18，24和30天，并检测培养过程中芘的含量变化。对样本DNA进行基于16s rRNA的扩增子测序以及宏基因组测序。宏基因组数据进行质检、拼接、组装。功能注释选择KEGG和COG数据库。使用R语言程序包计算OTU与代谢通路之间以及代谢通路与代谢通路之间的斯皮尔曼系数。使用Cytoscape软件进行网络构建。基于四碱基频率和丰度进行宏基因组分箱（Binging）。使用CheckM软件对分箱进行质量评估。基于分箱基因组注释数据进行功能代谢通路分析。
结果
1.芘降解菌群的组成和演替
将芘与河口沉淀物在液体培养基中共培养30天，芘被有效的降解。运用16S rRNA扩增子测序技术揭示了共培养过程中细菌菌群的动态演替特征。如图1A所示，原始系统的α多样性最高，并且空白对照在培养过程中菌群组成变化不大。实验组与对照组相反，菌群多样性在共培养12天之后显著下降。NMDS分析结果显示实验组菌群的β多样性在12天和24天发生很大的变化，在0-6天没有显著的变化（图1B）。变形菌门和拟杆菌门在所有的测序数据中均占据优势，在前6天，δ变形菌纲和丙型变形菌纲是菌群中的优势群体，在12-30天（培养后期），甲型变形菌和丙型变形菌纲是优势群体，尤其是在第30天。30天的样本中，甲型变形菌纲微生物的相对丰度上升到24.22%。在科水平上，交替单胞菌科在培养后期属于优势微生物，相对含量在32.3%到81.1%之间。在测序数据中，存在大量的未培养的细菌属ZD0117和未分类的交叉单胞菌科（图1C）。培养12天后，浮霉状菌属和海杆菌属成为丰度最高的微生物菌群。在培养后期，弧菌科的相对丰度显著下降。
图1在芘胁迫下，基于扩增子测序揭示微生物群落的多样性以及相对丰度。A基于Chao1指数的α多样性；B 基于NMDS分析微生物菌群差异；C 实验组与对照组中微生物组成以及相对丰度。
2.宏基因组测序和组装
本研究在不同的样本中获得66,961,902到407,387,960条原始reads。超过92%的reads属于高质量的并应用于后续的组装。组装结果显示：不同样本中的contig数量在145,251到4,710,445之间，组装长度在101,018,459到3,229,445,759 bp之间，不同样本中最长的contig分布在76,329到679,063 bp之间，最小的contig长度为200 bp，平均长度为685-1009 bp之间，Mapping率在22.53-72.33%之间。
3.代谢功能的多样性和转变
代谢功能使用KEGG和COG两个数据库分析。根据COG功能注释结果，在芘共培养后，关于转录，辅酶运输和代谢，脂质转运与代谢功能的基因增加，关于翻译，核糖体结构和生物发生，能源生产与转化，碳水化合物运输和代谢，翻译后修饰，蛋白质周转，伴侣，防御机制和信号转导机制的基因显著减少。
注释结果中发现关于芘生物降解的关键基因：protocatechuate 3,4-dioxygese (pcaH/A), salicylate hydroxylase和protocatechuate 4,5-dioxygese (ligA/B)，并且相比与对照组，实验组的降解基因的丰度更高（图2）。这些基因可以催化第一个环的降解并推动芘降解进入萘降解代谢途径。中间体进一步在其他关键酶的作用下催化降解，例如salicylate hydroxylase (EC:1.14.13.1)，催化后进入两个不同的代谢通路：苯甲酸降解和二甲苯退化。最后中间体进入糖酵解循化或者是TCA循环。
当芘作为一种环境胁迫添加时，不同群落中其他相关功能(如芳烃降解、脂质代谢、脂肪酸代谢、碳水化合物代谢、ATP合成、硫代谢、氮代谢和碳固定)随着时间的推移发生了什么以及如何变化？第一天，所有代谢途径的基因表现出急剧的增加，尤其是关于碳水化合物代谢，碳固定，ATP合成和脂肪酸代谢。但是关于碳水化合物代谢，碳固定和ATP合成的基因含量在第6天和第12天明显的减少了。经过18天的驯化，关于辅助因子和维生素的生物合成，碳固定，细菌分泌系统的基因相对丰度显著下降。同时，在第24天，大多数关于能够使细菌在胁迫条件下富集的代谢通路下降。在驯化1天后，大多数关于芳香烃降解基因的含量明显在增加。在12天和24天的样本中，这些基因的含量有所减少。
本研究利用重构网络揭示功能途径之间的协作关系（图3）。多环芳烃的功能基因（关于二甲苯降解，甲苯降解，苯降解，苯甲酸酯降解，邻苯二甲酸酯降解的基因）与其他代谢途径的基因（酰基甘油降解，固氮，硫酸盐转运系统，Arnon-Buchanan循环，细胞色素c氧化酶，甲醛同化、辅酶M生物合成、乙醛酸循环、琥珀酸脱氢酶、泛醌生物合成、卡尔文循环）表现出明显的相关关系（P<0.01,|ρ|>0.8）。对于能量代谢和氮固定，则与泛醌生物合成途径协同进行。
本研究应用斯皮尔曼相关性分析揭示了微生物与代谢特征之间的关系（以P<0.01,|ρ|>0.8作为指标判断显著性和相关性）。结果显示代谢通路和微生物之间存在显著的相关性。62个细菌属与不同的代谢通路具有相关性，例如，甲苯降解和二甲苯退化与一组未分类的细菌相关，表明这类微生物具有潜在的芘的降解能力。苯甲酸降解与海杆菌属和一些为未分类的物种显著相关，假单胞菌与多种代谢途径相关，包括甲烷代谢，碳水化合物代谢，ATP合成，硫代谢以及矿物和有机离子输运系统。
图2 宏基因组数据中关于芘降解功能基因的相对丰度。PRSED代表土著沉淀物样本。PRS01，PRS06，PRS12，PRS18，PRS24和PRS30分别代表芘处理1,6,12,18,24和30天后的沉淀物样本。
图3 共现性网络分析。红线代表负相关，黑线代表正相关。加粗的线代表关于PAHs代谢相关的代谢通路与其他代谢通路之间的相关关系。
4.MAGs/基因组bins
本研究获得56个宏基因组组装基因组（完整性>50%，污染度<10%）,基本信息如表1所示（基因组注释，CDS，rRNA，tRNA，完整性和污染度）。其中19个MAGs的完整度大于90%，8个MAGs的完整度在80-90%之间。GC%在32.4-72.26%之间。最大的基因组为10.21Mbp，最小的基因组是0.79Mbp（完整性51.46%）。这些bins的基因组差异较大，CDS分布在752-7117之间，基因数量分布在765-7189之间，tRNA的数量分布在6-71之间。
表1 所有基因组bins特征
5.MAGs的系统进化特征
基于系统发育分析结果显示（图4）：56个MAGs中18个属于丙型变形菌纲，15个属于甲型变形菌纲，11个属于拟杆菌门。组装结果与扩增子测序所获得的物种组成相似，丙型变形菌门和δ变形菌纲在前12天是主要的微生物，甲型和丙型变形菌门在后三个时间点是主要的微生物。根据CheckM的物种注释和基因组进化分析显示：MAGs M0041，M0043，M1805和M3007未能成功注视到明确的门。M3014的16S rRNA序列与EzBioCloud数据库比对结果显示：与未培养的Alphaproteobacterium的相似度为91.52%。通过16S rRNA的系统进化分析显示M3014有可能属于一个新目。M0603与未培养的卵形盐细菌相似度为92.31% (AM882611)。
图4 基于基因组分析发育进化关系。红色标红的微生物代表基因组中携带PAHs降解相关基因。
图5 重组基因中功能基因的丰度。蓝色方格代表其他代谢通路中相关基因的相对丰度；红色方格代表PAHs降解途径中相关基因的相对丰度。
6.MAGs的代谢潜力
56个MAGs中有20个含有PAHs降解酶，大部分属于变形菌门（图4-5）。功能基因（E1.14.-.-）存在于甲型变形菌纲（M0106，M0601，M2405，M2406和M3015），丙型变形菌纲（M0112）和δ变形菌纲（M0039）中，这个酶属于芘降解途径中的第一个酶。红杆菌科（M0106，M0601，M2406和M2407），未分类的甲型变形菌纲（M2405和M3015）含有双加氧酶。丙型变形菌纲（M2409）含有加氧酶（EC：1.14.13.-），该酶是菲降解的第一个酶。伯克氏菌目（M0105）含有邻苯二甲酸1,2-二氧化体系铁氧还蛋白亚基。M0603和M1202含有涉及苯甲酸降解的基因。
同时，本研究进一步分析了其他的代谢特征。30个MAGs中含有无机焦磷酸酶，18个MAGs含有链烷 1-单氧酶，表明这些微生物属于自养型，可以在芘的胁迫下提供能量。23个MAGs含有反硝化作用相关基因（norB/C，norZ）。13个MAGs含有硫氧化相关基因。9个MAGs含有丙酮酸羧化酶。30个MAGs中含有脂肪酸合成中的关键酶（fabA，fabI）。
7.芘降解细菌的代谢通路重构
为了更好地了解24天样本中关于芘的代谢特征（24天时芘的降解率，细菌菌群变化程度以及功能基因的变化程度均较大），本研究基于来自24天样本的4个MAGs重构了芘的降解代谢途径，揭示微生物之间的相互作用以及芘污染下细菌群落的共适应（图6），4个重组基因组包括M2405（甲型变形菌纲），M2406（红杆菌科），M2407（红杆菌科）和M2409（丙型变形菌纲）。
在M2405和M2406中发现了芘-4,5单氧酶，催化芘降解的第一步反应。在M2405和M2409中发现了4,5-dihydroxyphthalate decarboxylase（pht5；[EC:4.1.1.55]），催化由4-Hydroxyphthalate转化为3-Hydroxybenzoate。在不同的MAGs中均发现了涉及中间体代谢的苯酸盐代谢途径。M2406存在芘降解的另外一个途径：萘降解途径，发现了水杨酸羟化酶[EC:1.14.13.1]，负责催化1-Hydroxy-2-naphthoate生产1,2-Dihydroxynaphthoate。
氮代谢、硫代谢等能量代谢与芘的降解密切相关。大多数的MAGs中含有关于硫代谢相关的基因，M2406含有sat基因，M2406和M2407含有完整的SOX系统（硫氧化）。M2409含有大部分的SOX系统中的基因，缺少CysC和PAPSS基因。在重建的共代谢模型中发现了乙酰辅酶a还原途径（图6），M2406和M2407含有完整的葡萄糖/甘露糖转运系统，麦芽糖/麦芽糊精转运系统，2409只含有葡萄糖/甘露糖转运系统，M2405不含有任何转运系统。同时发现了多种电子传递链。
图6 基于MAGs构建的芘降解共代谢模型。
结论
本研究揭示了在芘胁迫下，微生物组的多样性，演替以及代谢机制。变形菌纲是芘降解的主要微生物。关于多环芳香烃降解基因与多种代谢途径相关，例如甘油酯降解，氮固定，硫转运系统，Arnon-Buchanan循环以及TCA循环。本研究还发现多环芳香烃的生物修复需要多种微生物的共同应对胁迫以及共同代谢降解。本研究同时揭示了多个未培养微生物的基因组并发现他们有可能是芘降解的执行者。
评论
本研究通过设计实验揭示了在典型多环芳香烃代表-芘的胁迫下，微生物菌群的结构以及功能的变化。结合宏基因组分析工具发现了多种未培养微生物的基因组并揭示了在芘降解中的功能。但是本研究未提供完整的芘生物降解机制，进一步获得更多的重构MAGs并深入分析将有助于补充芘的生物降解机制，与此同时可使用宏转录组和宏蛋白组也将有助于揭示芘降解的分子机制。