科研 | PBJ:植物激素如何影响种子活力?(国人佳作)

编译:寒江雪,编辑:十九、江舜尧。

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导读

本研究以水稻为材料,克隆糖基转移酶基因OsIAGLU,并对其在种子活力中的作用进行了研究。OsIAGLU基因的突变导致水稻种子活力降低。在种子发育后期和萌发早期,OsIAGLU的表达相对较高,且受吲哚乙酸(IAA)和脱落酸(ABA)诱导。转录组分析表明,IAA和ABA相关基因参与OsIAGLU调控种子活力。与野生型(WT)相比,osiaglu突变体萌发种子中游离IAA和ABA含量较高。经过外源IAA和ABA处理后,突变体和WT对ABA敏感,而对IAA不敏感,但外源IAA使得由ABA诱导的种子活力降的更低。与野生型相比,osiaglu突变体萌发种子中OsABI3OsABI5持续高表达。OsIAGLU通过调节IAA和ABA水平来调控水稻种子活力。研究人员又对种质资源SNP进行分析,确定了两个与种子活力呈正相关的单倍型。本研究为深入了解OsIAGLU在水稻种子活力中的作用提供了重要的依据,也为OsIAGLU在水稻育种中的实际应用提供了便利。

论文ID

原名:Indole-3-acetate beta-glucosyltransferase OsIAGLU regulates seed vigour through mediating crosstalk between auxin and abscisic acid in rice

译名:3-乙酸吲哚β-葡萄糖基转移酶OsIAGLU通过水稻中生长素和脱落酸之间的互作来调节种子活力

期刊:Plant Biotechnology Journal

IF: 6.84

发表时间:2020.3

通讯作者:王州飞

通讯作者单位:华南农业大学农学院

DOI号:10.1111/pbi.13353

实验设计

本研究分别测定野生型和osiaglu突变体的种子粒活力。以野生型为模板扩增OsIAGLU基因对其功能进行研究,包括表达模式分析及亚细胞定位等。选取野生型和突变体子粒发育过程中开花后0, 7, 14, 21和28天(DAF),发芽过程中吸胀后0,4,8,12,18,24,36,48,60和72h的子粒进行转录组测序,对差异表达基因进行代谢通路分析。再分别用GA,IAA和ABA处理野生型和突变体,测定表型验证基因的调控作用。最后通过SNP进行单倍型分析寻找籼粳稻之间的差异。

结果

1 OsIAGLU突变导致种子活力降低

水稻OsIAGLU位于第11号染色体上,推测含有504个氨基酸。系统发育树表明与玉米中的IGAU关系较近。为了进一步验证OsIAGLU的功能,研究人员利用CRISPR / Cas9构建了突变体osiaglu-1osiaglu-2 和osiaglu-3(图1a)。osiaglu-1osiaglu-2osiaglu-3突变株在OsIAGLU的外显子上分别含有59、58和5bp的缺失(图1b)。OsIAGLU的突变导致种子发芽速度降低和幼苗生长缓慢。与WT相比,osiaglu-1osiaglu-2osiaglu-3的发芽率提高了50%,而发芽指数和幼苗活力指数显着降低(图1c-g)。大田环境下,三个突变株系的出苗率和幼苗生长性状(包括根长、茎长和幼苗干重)均显著低于野生株系(图1h-l)。所有这些结果表明,OsIAGLU在水稻种子活力调控中起重要作用。

图1 WT和突变体种子活力的比较。a WT和突变体的基因结构。b 三个突变体分别有59、58和5bp核苷酸被敲除。c WT和突变体种子萌发5和7天后表型。d 发芽率达到50%时间。e 发芽势 f 发芽指数 g 幼苗活力指数 h WT和突变体在直播条件下成苗7和9天后表型。i 出苗率 j 根长 k 芽长 l 幼苗干重。

2 OsIAGLU和表达模式分析和亚细胞定位

RT-PCR结果显示开花后0~28天(DAF),籽粒中OsIAGLU的表达量逐渐增加,28DAF后急剧增加(图2a)。早期种子萌发吸胀4h时,OsIAGLU的表达量较高(图2a)。在12~72h内,IAA和ABA均能明显诱导OsIAGLU的表达,IAA和ABA的诱导作用强于GA(图2b)。GUS染色发现对照组、IAA和ABA处理条件下,在萌发种子的胚和芽中,OsIAGLU在12-72h内均呈高表达(图2c)。亚细胞定位结果说明OsIAGLU在细胞质中特定表达(图2d)。OsIAGLU在种子萌发过程中的特异表达表明它在调节种子活力中起作用。

图2 OsIAGLU在水稻中的表达模式及亚细胞定位。a 不同时期OsIAGLU的表达模式。b GA3、ABA和IAA处理后OsIAGLU的表达水平。c 对照组、IAA和ABA处理条件下种子萌发过程中OsIAGLU 的GUS染色结果。d OsIAGLU在水稻原生质体中的亚细胞定位。

3 OsIAGLU种子萌发过程中IAA和ABA水平

为了进一步研究OsIAGLU的功能,选择吸胀72h的osiaglu-2和WT转录组数据进行差异分析。两组间鉴定到9121个差异表达基因(DEG),与WT相比,osiaglu-2中有3148个基因显著上调,5973个基因显著下调(图3a)。通过MapMan分析,有222个DEG显著富集在激素代谢。其中,大多数与激素相关的DEG参与了IAA(77)、ABA(23)、茉莉酸(JA)(22)和乙烯(ETH)(60)的代谢(图3b)。

RNA-Seq数据表明OsIAGLU参与种子萌发过程中IAA和ABA代谢的调节。因此推测在水稻种子萌发过程中,OsIAGLU调节IAA和ABA的水平。与WT相比,突变体种子萌发后的12-72小时内,IAA和ABA水平普遍升高(图3c-d)。在成熟的种子中osiaglu突变体的IAA和ABA水平普遍也高于WT。结果表明,OsIAGLU对种子萌发过程中内源IAA和ABA水平有明显的调节作用

图3 OsIAGLU对水稻种子萌发过程中IAA和ABA含量的影响。a 种子萌发72h中WT和osiaglu-2差异表达基因。b DEG参与激素代谢。c-d WT和osiaglu突变体种子萌发中IAA和ABA的含量。

4 OsIAGLU种子活力ABA与IAA相互作用有关

OsIAGLU影响种子萌发过程中的游离IAA和ABA水平,突变体中较高的游离IAA和ABA积累可能导致种子活力降低。用5 μM和10μM外源IAA和ABA处理种子,发现外源施加IAA,对照组、WT及突变体种子活力(发芽时间、发芽率和发芽指数)没有明显差异(图4a)。在外源IAA存在下,不同处理和对照的osiaglu突变体和WT植株的种子活力,包括50%发芽率、发芽率和发芽指数,均无显著差异(图4b-d)。但突变体和WT植株的种子活力显著降低,且突变体种子活力最低(图4e-g)。与WT相比,osiaglu突变体ABA更敏感且种子活力较低。在外源ABA加入的同时加入不同浓度的IAA(图5),发现与ABA处理相比,IAA+ABA处理显著降低了种子活力,说明外源IAA使得ABA介导的水稻种子活力更低。这些结果表明,OsIAGLU基因敲除使得过量的ABA和IAA积累以及它们在水稻中的相互作用导致种子活力降低。

图4 IAA和ABA处理对WT和osiaglu突变体种子活力的影响。a IAA和ABA处理下WT和osiaglu突变体萌发7d。b-d WT和osiaglu突变体50%发芽率、发芽势、发芽指数与IAA处理的比较。e-g WT和osiaglu突变体种子活力(50%发芽率的时间、发芽势、发芽指数)与ABA处理的比较。
图5 IAA和ABA对水稻种子活力的相互作用。a 对照组、IAA、ABA和IAA+ABA处理种子萌发7d表型。b-c对照组、IAA、ABA和IAA+ABA处理种子萌发过程中50%发芽率和发芽势的动态变化比较。d-e 对照组、IAA、ABA和IAA+ABA处理对50%发芽率和发芽指数的影响。

5 OsIAGLU调控种子活力OsABIs表达中有关

RNA-seq结果发现与IAA相关的DEG,包括TIR1(1)、AUX/IAA(15)和ARF(9)都参与了IAA信号传导过程(图6a),与ABA相关的DEG,包括ABA合成/降解(10)、ABA信号转导(5)和ABA应答基因(8)参与ABA信号转导过程,与ABA相关的DEG,包括ABA合成/降解(10)、ABA信号转导(5)和ABA应答基因(8)也都参与ABA信转导过程(图6b)。与WT相比,突变体植株在72h时,ARF,ABA相关基因表达量升高(图6a,b)。说明在水稻种子萌发过程中,OsIAGLU通过调节IAA和ABA信号调控种子活力。

图6水稻水稻OsIAGLU在种子萌发过程中改变了IAA和ABA信号传递相关基因的表达。

ABI是ABA信号通路的下游因子,在种子萌发过程中起着关键作用。在水稻种子萌发过程中,OsABI3OsABI5的表达受OsIAGLU的调控。OsABI3OsABI5在对照组和IAA和ABA处理组中的表达情况见图7a-d,在突变体中的表达量高于WT(图7e和f)。分析两个基因在不同时间段的表达模式发现,OsABI3OsABI5在种子萌发过程中的持续高表达导致了osiaglu突变体植株种子活力的降低。

图7水稻OsIAGLU在种子萌发过程中调控ABA信号基因OsABI的表达。IAA(a-b) 和ABA(c-d)处理下不同时间点OsABI3OsABI5的表达。WT和突变体种子萌发过程中OsABI3(e)和OsABI5(f)的表达。

6 OsIAGLU单倍型与种子活力的关系

本研究发现籼稻品种的种子活力比粳稻品种更强(图8a和b)。为了研究OsIAGLU等位基因的变化是否与两个亚种之间种子活力的差异有关, 对OsIAGLU上游2kb到下游1kb区域的SNP进行分析。在这些材料中鉴定出5个OsIAGLU单倍型(图8c)。与种子高活力相关的Hap 1和Hap 2与主要存在于籼稻,与种子低活力相关的Hap 3、Hap 5主要存在于粳稻,Hap 4两者都有。与Hap 3、Hap 4或Hap 5相比,Hap 1和Hap 2中OsIAGLU的表达量更高(图8c-e)。因此研究人员推测OsIAGLU的SNP在种子萌发过程中影响基因表达量,从而调节种子活力。与Hap 3、Hap 4或Hap 5单倍型相比,含有Hap 1或Hap 2单倍型(高种子活力)的材料中OsIAGLU的表达显著增加(图8f-g)。因此OsIAGLU变异与粳稻和籼稻种子活力差异相关。

图8与水稻种子活力相关的OsIAGLU单倍型。籼粳品种种子发芽率(a)和发芽指数(b)的比较。c 在该基因上游~2kb到下游~1kb的区域鉴定出OsIAGLU的单倍型。d-e 不同单倍型材料的萌发表型。f-g 不同单倍型种子萌发过程中OsIAGLU的相对表达水平。

结论

研究人员利用构建的日本晴水稻突变体,初步阐明了水稻OsIAGLU基因通过调控种子萌发过程中生长素(IAA)、脱落酸(ABA)含量,引起下游ABA信号因子OsABI表达变化,决定水稻种子活力水平;同时发现水稻OsIAGLU基因在籼粳稻之间存在等位变异,引起籼稻种子萌发过程中该基因表达显著高于粳稻,解释了籼稻种子活力高于粳稻的原因。本研究结果也为水稻种子活力的遗传改良奠定了基础。

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