科研 | Cancer Res.：YAP和β-catenin在基底样乳腺癌中协同驱动肿瘤发生的机制研究

编译：微科盟陌陌谦行，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读

靶向癌症干细胞（CSC）可以作为一种有效的方法来应对治疗的耐药性。尽管基底样（三阴性）乳腺癌包含具有CSC特征的细胞，但治疗方法仍然不完善。研究者发现，受体酪氨酸激酶Met可以促进基底样乳腺癌中的YAP活性，并在CSC中发现增强的YAP活性。干扰YAP活性可延缓基底样乳腺癌的形成，阻止管腔样向基底样的反分化，并降低CSC。YAP敲除的乳腺中β-catenin靶基因表达减少，表明YAP是β-catenin活性所必需的。核YAP通过在基因调控元件上与β-catenin、TEAD4相互作用，调控β-catenin靶基因表达。患者的蛋白质组学数据显示，在基底样乳腺癌中，YAP信号上调。该研究表明，在基底样乳腺癌中，β-catenin活性依赖于YAP信号传导，进而调控CSC进程。该研究的意义在于，靶向YAP / TEAD4 /β-catenin复合物为根除基底样乳腺癌中的CSC提供了潜在的治疗策略。

论文ID

原名：YAP and β-catenin cooperate to drive oncogenesis in basal breast cancer

译名：YAP和β-catenin在基底样乳腺癌中协同驱动肿瘤发生的机制研究

期刊：Cancer Research

IF：9.727

发表时间：2021.02

通讯作者：Walter Birchmeier

通讯作者单位：德国马克斯·德尔布吕克分子医学中心

实验设计

1.通过单Wnt突变和Wnt-Met双突变小鼠乳腺早期蛋白质组学和基因表达分析，测定YAP和β-catenin活性。

2.通过遗传学（敲除）和药理学（使用抑制剂）手段验证YAP的功能。

3.Wnt-Met双突变小鼠YAP敲除小鼠乳腺中管腔样细胞标志物CK8和基底样细胞标志物P63的表达，以及相关基因的表达检测，Wnt-Met信号传导介导管腔样向基底样转变是否依赖于YAP。

4.通过免疫荧光、免疫印迹、靶基因表达检测等方法，确定基底样小鼠乳腺肿瘤的癌症干细胞中YAP的活性。

5.体外建立了富含乳腺干细胞的对照Sphere、Wnt-Met Sphere等，观察Sphere的生长增殖和YAP的活性之间的关系。

6.对照组和Wnt-Met-YAPKO乳腺的Nanostring基因表达分析，检测YAP和β-catenin靶基因表达，研究YAP对β-catenin的影响。

7.患者蛋白质组学数据分析，评估YAP在乳腺癌肿瘤患者预后中的意义。

实验结果

1.受体酪氨酸激酶Met在肿瘤发生的早期阶段调节YAP和β-catenin活性

带有单Wnt或Met突变的小鼠在产后（PP）的30至40周内发展为乳腺肿瘤，而双突变体则在PP两周之内就发展为肿瘤（Wnt-Met 肿瘤）。Wnt-Met双突变型乳腺在肿瘤发生早期的蛋白质组学分析显示，YAP信号显著上调，表明YAP在双突变体中激活，但在单个突变体中未被激活（图1A）。Wnt-Met双突变型乳腺的YAP阳性细胞核比Wnt单突变的小鼠多6倍（图1B、C），活性YAP的蛋白质印迹也证实了这一点（图1D）。磷酸化蛋白质组数据显示，YAP在S46和T48位点的磷酸化水平较高，表明这些位点在YAP的作用机制中极为重要。

在Wnt-Met双突变小鼠的乳腺中，YAP和Wnt靶基因Birc5、Ctgf、Cd44和Lgr5的表达水平较高（图1E）。研究者检测了Met信号传导是否与β-catenin的核易位有关，与Wnt单突变的乳腺相比，双突变体的核β-catenin增加了10倍。研究者还检查了用Met抑制剂PHA665752处理的Wnt-Met双突变型乳腺中YAP和Wnt靶基因的表达。值得注意的是，Rt-PCR实验结果证实了Ctgf、Ccnd1（CyclinD1）及其它基因的表达水平显著降低（图1F）。这表明RTK Met是Wnt-Met双突变小鼠乳腺中YAP和β-catenin核转运所必需的。

图1 HGF-Met信号传导调节YAP活性

A.蛋白质组学分析的热图，比较PP1周时Wnt单突变和Wnt-Met双突变乳腺YAP信号。B.PP1周时Wnt单突变和Wnt-Met双突变乳腺中YFP（绿色）和活性YAP（红色）的免疫荧光图像，比例尺20μm。C. Wnt单突与Wnt-Met双突组织中YAP阳性细胞核的定量（YAP ⁺细胞核/每个视野的细胞核数x 100）。数据是平均值±SEM，n = 3个生物学重复，***p <0.001，通过Student's t检验。D. PP第1周时Wnt单突和Wnt-Met双突组织中活性YAP的免疫印迹图。E.在第1周PP时，Wnt单突和Wnt-Met双突组织中的YAP和Wnt靶基因的RT-qPCR。数据是平均值±SEM，n = 3个生物学重复，* p<0.05，** p <0.01，通过Student's t检验。F.经过PHA665752处理的Sphere中YAP和Wnt靶基因的热图。

2.遗传学和药理学证据表明基底样乳腺肿瘤依赖于YAP活性

研究者通过遗传学和药理学干扰手段验证YAP的功能。研究者将FloxedYAP等位基因杂交入Wnt-Met双突变小鼠。通过怀孕刺激后，纯合的YAP基因在Wnt-Met双突变小鼠中被切除，称为Wnt-Met-YAP^KO，并且与对照组（Wnt-Met-YAP^Ctrl）相比，无肿瘤小鼠的存在的天数增加至17天（图2A），Wnt-Met-YAP^KO小鼠乳腺肿瘤的平均重量也发生了降低（图2B）。研究者通过qPCR实验确认了YAP基因被切除（图2C）。Wnt-Met-YAP^KO小鼠乳腺的H＆E染色和免疫组化显示有大空泡，这些空泡大多不含YAP，还显示出一层健康的腺泡。通过Ki-67染色，它们被证实增殖水平较低（图2D、图2E）。相反，Wnt-Met-YAP^Ctrl小鼠乳腺显示较大的肿瘤区域，这些区域可被YAP染色，且没有大的空泡（图2D）。值得注意的是，YAP在Wnt-Met-YAP^KO小鼠乳腺发生的肿瘤中检测到表达，但是无YAP的区域仍保持为单层健康腺泡。YFP的荧光图像证实了乳腺上皮细胞的成功重组；研究者在Wnt-Met-YAP^KO小鼠乳腺单层腺泡中发现了YFP阳性细胞，与对照中的充满整个肿瘤的现象相反（图2F）。据报道，YAP在怀孕期间对乳腺极为重要；qPCR分析证实研究者的无肿瘤表型并不是Wnt-Met-YAP^KO乳腺中Wap表达水平降低的结果；此外，在WAP启动子控制下的YAP敲除在怀孕期间不会改变正常的乳腺。

研究者用两种YAP活性抑制处理Wnt-Met双突小鼠：辛伐他汀（SIM）和维替泊芬（VP）。辛伐他汀（SIM）通过mevalonate-Rho激酶途径抑制YAP；维替泊芬（VP）抑制YAP与其转录激活因子TEAD的相互作用。尽管动物最终会发展成小肿瘤，但两种抑制剂均能降低肿瘤体积和重量。与对照组相比，SIM和VP处理的肿瘤经H＆E染色和免疫组化后，显示出小而空的泡，Ki-67阳性细胞减少，Ctgf的表达水平降低。据报道，TAZ对于调节乳腺CSC非常重要。实验结果显示，尽管TAZ在Wnt-Met-YAP对照和Wnt-Met-YAP^KO肿瘤中高表达，但Wnt-Met-YAP^KO乳腺仍然是健康的单层腺泡，暗示TAZ无法补偿YAP敲除。这些数据表明，YAP对于Wnt-Met肿瘤中的肿瘤增殖和生长至关重要。

图2 YAP的遗传敲除延迟了Wnt-Met肿瘤的形成

A.Wnt-Met、Wnt-Met-YAP^Ctrl和Wnt-Met-YAP^KO组中无肿瘤小鼠的百分比统计图，** p ＜0.001，通过Gehan-Breslow-Wilcoxon检验。B.Wnt-Met-YAP^Ctrl和Wnt-Met-YAP^KO组小鼠的肿瘤平均重量。数据为平均值±SEM，* p <0.05，通过Student'st检验。C. RT-qPCR检测Wnt-Met-YAP^Ctrl和Wnt-Met-YAP^KO肿瘤中Yap mRNA。数据是平均值±SEM，n = 3个生物学重复，***p <0.001，通过Student's t检验。D.比较在PP 2.4周时Wnt-Met-YAP^Ctrl（上图）和Wnt-Met-YAP^KO（下图）乳腺组织。H＆E染色（左图），YAP的免疫组化（中图）和Ki-67（右图），红色箭头标记单细胞层健康无YAP的上皮，比例尺50μm和20μm。E.Ki-67阳性细胞的定量。数据是平均值±SEM，n = 3个生物学重复，* p<0.05（通过Student’s t检验）。F. Wnt-Met-YAP^Ctrl和Wnt-Met-YAP^KO乳腺中YFP（绿色）在PP 2.4周时的共聚焦图像，比例尺为20μm。

3. Wnt-Met信号传导介导YAP依赖的管腔样向基底样转变

Met信号通路控制Wnt-Met肿瘤细胞的分化。为了确定Wnt-Met肿瘤细胞是来自腔内细胞还是基底细胞，研究者研究了Wap-cre;YFP^rosa26小鼠在诱导的各个阶段的WAP-cre活性。免疫荧光和流式分析结果显示，在整个WAP-cre诱导过程中，以YFP表达为标志的WAP-cre活性几乎仅在CK8阳性的CD24⁺ CD49f⁺腔细胞中被发现；但是，在激活Wnt和Met信号后，YFP⁺腔细胞在PP后0至2周之间逐渐从CK8阳性、CD24^hi、CD49f⁺转变为P63阳性、CD24^hi、CD49f^hi基底细胞（图3A和B），在此过程中，还伴随着EMT基因Slug和Twist的表达逐渐增加，这两个基因的表达在管腔细胞对基底细胞的分化过程中发挥着重要的作用（图3C）。为了验证管腔细胞向基底细胞的转化是否依赖于YAP，研究者检测了Wnt-Met-YAP^Ctrl和Wnt-Met-YAP^KO乳腺中管腔样细胞标志物CK8和基底样细胞标志物P63的表达。研究者发现，在对照乳腺中P63的表达水平较高，CK8的表达水平较低（图3D、E，左图）。Wnt-Met-YAP^KO乳腺的P63阳性细胞极少，但CK8阳性细胞却很多（图3D、E，右图）；另外，在Wnt-Met肿瘤中，研究者发现了CK14的高表达和CK8的低表达，而在SIM处理的肿瘤中正相反。研究者还观察到，YAP缺失导致EMT基因Slug和Twist的表达显著降低，这表明YAP通过调节EMT来调控管腔细胞至基底细胞的转化（图3F）。总的来说，这些数据提供了遗传学和药理学方面的证据，证明在Wnt-Met肿瘤中YAP是获得基底样细胞特征所必需的。

图3 Wnt-Met信号传导介导管腔样向基底样的转变依赖于YAP

A. Wnt-Met乳腺中YFP（绿色）CK8（红色，上方）和P63（红色，下方）的共聚焦图像，比例尺为20μm。B.怀孕10天和0天PP时Wnt-Met乳腺的FACS图。C. PP第0、1和2周时，Wnt-Met乳腺中EMT基因的RT-qPCR。数据为平均值±SEM，n = 3个生物学重复，* t <0.05，** p <0.01，通过Student's t检验。D.在Wnt-Met-YAP^Ctrl和Wnt-Met-YAP^KO乳腺中YFP（绿色）和CK8（红色）在2.4周PP时的共聚焦图像，比例尺为20μm。E. Wnt-Met-YAP^Ctrl和Wnt-Met-YAP^KO乳腺中YFP（绿色）和P63（红色）的共聚焦图像，PP为2.4周，比例尺为20μm。F.在2.4周PP时，在Wnt-Met-YAP^Ctrl和Wnt-Met-YAP^KO乳腺中EMT基因的RT-qPCR。数据是平均值±SEM，n= 3个生物学重复，* p <0.05，通过Student’s t检验。

4. YAP在基底样小鼠乳腺肿瘤的癌症干细胞中处于激活状态

研究者之前已经证明WAP-Cre诱导的Wnt-Met肿瘤含有CD24^hi和CD49f^hi/CD29^hi肿瘤干细胞，这些干细胞移植到免疫缺陷小鼠，将形成侵袭性基底样癌细胞。研究者对YAP在Wnt-Met CSC发挥的作用进行研究，通过使用针对YAP激活状态的特异性抗体，研究者在Wnt-Met肿瘤腺泡的外缘发现了高表达水平的核YAP，这与特定干细胞基因（例如CD44和Sox10）的表达水平增加相关（图4A）。研究者通过蛋白质印迹和mRNA表达证实了高水平的YAP（图4B、C）。而且，Wnt /β-catenin和YAP的靶基因包括Axin2，Ccnd1，Ctgf和Igfbp3的表达水平也有所增加（图4D、E）。

据报道，在许多组织的干细胞中，YA活性处于较高水平。如流式分析所示，YFP⁺CD24^hiCD49f^hi癌症干细胞存在于肿瘤的基底细胞群中，但该细胞在管腔细胞群中未被发现。管腔细胞群中主要包含YFP^-CD24⁺CD49f⁺细胞（图4F）。据报道，CK14标记的基底样细胞中存在CSC。与此相符的是，研究者发现YAP在基底样CK14阳性细胞的细胞核中表达，但在管腔CK8阳性的细胞中不表达（图4G）。此外，与其他肿瘤上皮细胞（TEC）相比，CSC中的YAP靶基因表达水平更高（图4H、I）。这些数据表明，在乳腺的CSC中，Wnt-Met信号产生具有高YAP活性的基底样肿瘤。

图4 在Wnt-Met介导的乳腺肿瘤CSC中YAP被激活

A.产后两周（PP）Wnt-Met肿瘤中活性YAP的免疫组化图像，比例尺20μm。B.在PP 2周时对照组和Wnt-Met肿瘤的免疫印迹，显示活性YAP，GAPDH作为内参。数据显示为平均值±SEM，n = 3个生物学重复，** p <0.01，通过Student’s t检验。C. PP 2周时，对照组和Wnt-Met肿瘤中Yap表达的RT-qPCR检测。数据显示为平均值±SEM，n = 3个生物重复数，***p <0.001，通过Student’s t检验。D.PP2周时，对照组和Wnt-Met肿瘤中Wnt靶基因的RT-qPCR检测。数据显示为平均值±SEM，n = 3个生物学重复，** p <0.01，*** p <0.001，通过Student’s t检验。E.在PP 2周时，对照组和Wnt-Met肿瘤中YAP靶基因的RT-qPCR。数据显示为平均值±SEM，n = 3个生物学重复，**p <0.01，*** p <0.001，通过Student’st检验。F.FACS显示Wnt-Met肿瘤细胞的YFP、CD24和CD49f。G.YAP（绿色）、CK8（红色）和CK14（红色）的免疫荧光图像，比例尺5μm。H. FACS显示从Wnt-Met肿瘤中分离出癌症干细胞（CSC）和肿瘤上皮细胞（TEC）。I.TEC和CSC中YAP靶基因的RT-qPCR。数据是平均值±SEM，n= 5个生物学重复，* p <0.05，** p<0.01，*** p <0.001，通过Student'st检验。

5.YAP调节Wnt-Met癌症干细胞的起始和扩增

为了研究YAP在CSC中的功能，研究者首先在促进乳腺干细胞的培养基中建立了富含干细胞的对照Sphere和Wnt-Met Sphere。与Wnt-Met Sphere产生的大型填充结构相比，对照细胞（WAP-Cre;ROSA26 ^EYFP）形成具有空内腔的单层上皮结构（图5A）。YFP的流式分析显示，Wnt-Met Shpere所含的YFP阳性细胞比对照多1.4倍（57％至76％）。它们还表现出较高的转化基因表达，如Wap、Hgf和Lgr5。免疫荧光显示管腔细胞标志物CK8减少，基底样细胞标志物CK14增加。此外，研究者在位于Sphere表面的基底样细胞中观察到强核β-catenin信号（图5B），他们通过流式细胞仪分离细胞并接种相等数量的细胞以产生富含干细胞的Sphere，发现CSC细胞数量相对于TECs增加了8倍。这表明Sphered对Wnt-Met乳腺肿瘤中的CSC有富集和增值作用。研究者在肿瘤来源Sphere中通过免疫荧光鉴定出了核YAP并通过qPCR量化分析YAP靶基因的表达。研究者发现Cyr61表达增加了2.5倍，Igfbp3增加了3.7倍。

为了进一步了解YAP的功能作用，研究者使用SIM和VP抑制YAP活性。由于VP可能具有脱靶作用，因此研究者高浓度VP处理了Wap-Cre; YFP细胞，但未观察到细胞数量的变化，排除Wnt-Met肿瘤细胞中细胞增殖的减少是由于毒性的可能。BrdU和Ki-67免疫荧光测定到Wnt-Met Sphere中细胞的增殖水平有所下降（图5C）。与干细胞相关的基因Itga6，Kit和Prom1的表达分析，表明CSC受到了抑制（图5D）；此外，Sphere起始增殖被VP抑制了2.8倍（图5E，右侧定量）。研究者还用YAP特异性的shRNA和siRNA处理了细胞，Wnt-Met细胞产生的Sphere大小减少了4倍，而MDA-231细胞产生的Sphere大小减少了2.5倍，MDA-231细胞也具有高Wnt和YAP活性，这表明YAP对于功能获得性（GOF）和野生型（WT）细胞中的β-catenin都是必不可少的。流式分析结果显示，与对照组相比，Wnt-Met-YAP^KO乳腺中CD49f^hi CD24^hiCSCs的含量降低了3倍（图5F、G）。与对照组相比，RT-qPCR显示Wnt-Met-YAP^KO乳腺中Yfp的表达相同（图5H）；此外，由Wnt-Met-YAP^KO乳腺产生的Sphere比对照小6倍（图5I）。这表明YAP活性对于Wnt-MetCSC的生长、起始和自我更新至关重要。

图5 YAP调节癌症干细胞特性

A.对照组和Wnt-Met肿瘤产生的富含干细胞组织切片的H＆E染色，比例尺20μm。B. Wnt-Met干细胞富集Sphere的共聚焦图，CK8（橙色），CK14（绿色）和β-catenin（红色），比例尺50μm。C.DMSO对照（左）或2μMVerteporfin（右）处理48小时的干细胞富集Sphere（>50μm）中BrdU（绿色）的共聚焦图像，右侧为定量结果。数据是平均值±SEM，n = 3个生物学重复，* p<0.05，通过Student’s t检验。D.DMS对照或经VP处理的干细胞富集Sphere（>50μm）处理48小时的Itga6、Kit和Prom1 mRNA的Log2值。数据为平均值±SEM，n = 3个生物学重复，* p<0.05，通过Student’s t检验。E.Wnt-Met干细胞富集Sphere的明场和荧光图像。从第一天开始，用DMSO对照（左）或2μMVP（右）处理细胞。右侧为CellTitre-Glo发光定量，比例尺50μm。数据是平均值±SEM，n = 3个生物学重复，**p <0.01，通过Student’s t检验。F.FACS图显示了在Wnt-Met-YAP^Ctrl和Wnt-Met-YAP^KO乳腺中YFP⁺、CD24^hi、CD49f^hi细胞的百分比。G.Wnt-Met-YAP^Ctrl和Wnt-Met-YAP^KO乳腺中CD24^hi、Cd49^hiCSC的定量。数据为±SEM，n = 3个生物学重复，* p <0.05，通过Student's t检验。H.通过FACS分离的Wnt-Met-YAP^Ctrl和Wnt-Met-YAP^KO YFP⁺细胞中Yfp的RT-qPCR。数据为平均值±SEM，n= 3个生物学重复，n = s =不显著，通过Student’st检验。I.由Wnt-Met-YAP^Ctrl和Wnt-Met-YAP^KO组织产生的富含Wnt-Met干细胞Sphere的明场和荧光图像，比例尺为20μm。右侧为Sphere数量的量化。数据是平均值±SEM，n = 3个生物学重复，*** p <0.001，通过Student’s t检验。

6. YAP是Wnt-Met乳腺肿瘤中β-catenin活性所必需的

研究者进行了对照组和Wnt-Met-YAP^KO乳腺的Nanostring基因表达分析，Wnt-Met-YAP^KO乳腺的YAP和β-catenin活性明显降低（图6A）。该组织中靶基因表达下调，如Ctgf和Igfpb3（YAP靶标）以及Axin2和BMP4（β-catenin靶标），VP处理过的Sphere细胞也出现了同样的现象（图6B、6C）。定量结果显示，敲除YAP后，β-catenin阳性细胞核减少了11倍（图6D），而且通过药理方式抑制YAP，β-catenin阳性细胞核也减少了。在MDA-MB-231细胞中通过对YAP的siRNA敲低，研究者观察到了相似的结果，这表明在不存在YAP的情况下，β-catenin不能转运至细胞核并转录靶基因。

在没有Wnt信号传导的情况下，YAP和β-catenin的相互作用与β-catenin 破坏复合体相关。免疫荧光图像显示，YAP和β-catenin在Wnt-MetSphere和肿瘤细胞的细胞核中发生共定位（图6E）。活性YAP与Wnt-Met sphere中的β-catenin^GOF和Tead4免疫共沉淀，但不与野生型β-catenin免疫共沉淀（图6F）；另外，细胞质中的p-YAP与β-catenin和LATS1发生免疫共沉淀，这表明YAP和β-catenin在细胞质和细胞核中存在相互作用。

据报道，YAP是β-catenin介导的肿瘤进展所必需的。由于YAP抑制导致许多Wnt靶基因的表达减少，因此研究者假设YAP / TEAD可能在常见靶基因的启动子或增强子区域与β-catenin结合，以调节这些靶基因在CSC中的表达。研究者从ChIP-Atlas获得了YAP1，TEAD4和CTNNB1（β-catenin）的ChIP-seq数据。由于YAP优先结合增强子区域而不是启动子，因此研究者探究了YAP / TEAD4 /CTNNB1是否占据共同的基因组区域。研究者发现，YAP / TEAD4 / CTNNB1在基因组的601个区域具有重叠的峰。在Wnt和YAP靶基因的深度分析中，除了NUAK2（新鉴定的YAP靶基因）、AMOTL2和CCN2的增强子和启动子区域，研究者还发现AXIN2、CD44和BCL2L2等基因的增强子区域也包含重叠的CTNNB1、TEAD4和YAP1 的ChIP-seq峰（图6G）。这些数据表明，TEAD4、CTNNB1和YAP1相互作用，并且可以共同结合于Wnt和YAP靶基因的基因启动子和增强子上。

图6 乳腺肿瘤中β-catenin的活性取决于YAP

A.热图，显示了Wnt-Met-YAP^Ctrl和Wnt-Met-YAP^KO小鼠中YAP和β-catenin靶基因的差异表达。B. YAP目标基因Ctgf、Cyr61和Igfbp3的Log2值。C.β-catenin靶基因Axin2，Bmp4和Mycn的Log2值。数据是平均值±SEM，n =3个生物学重复，* p <0.05，*** p<0.001，通过Student's t检验。D.Wnt-Met-YAP^Ctrl和Wnt-Met-YAP^KO小鼠中β-catenin（红色）的共聚焦图像。右侧为核β-catenin的定量结果。数据是平均值±SEM，n = 3个生物学重复，* p <0.05，通过Student’s t检验。E.在富含干细胞的Sphere（上部）和Wnt-Met肿瘤（下部）中，β-catenin（红色）和活性YAP（绿色）的共聚焦图像，比例尺10μm。F.免疫印迹显示在Wnt-MetSphere中活性YAP与β-catenin和TEAD4的免疫共沉淀。G. YAP、β-catenin、TEAD4的ChIP-seq结果中，增强子区域显示重叠信号。

7. YAP在人基底样乳腺癌中处于激活状态，对患者存活率具有一定的预见性

研究者对患者蛋白质组学数据进行分析，结果显示，与其他乳腺癌相比，YAP标志物在基底样乳腺癌中高表达（图7A）。YAP靶基因CTGF、IGFBP3和ANKRD1的qPCR结果说明，与基底细胞系MCF7、BT474和T47D相比，在人基底样乳腺癌细胞系BT549、MDA231和SUM1315中YAP活性较高（图7B）。从Breastcancer Online（GoBo）获得的基因表达数据证实，基底样乳腺癌人类患者的肿瘤中YAP的表达水平高于管腔型乳腺癌患者；对10个基底样乳腺癌PDX模型中的YAP进行免疫荧光染色分析，研究者发现了核YAP和β-catenin强信号（图7C）。

研究者还发现，管腔（ER +，PR +）乳腺癌和基底样即三阴性（HER2-，ER-，PR-）乳腺癌的YAP表达水平与患者生存率之间存在相反的关系，如Kaplan Meier分析所示（图7D、E）。在管腔乳腺癌中YAP高表达则患者生存率增加，而在三阴性乳腺癌患者中YAP高表达则存活率下降。三阴性乳腺癌患者中，YAP靶基因（如CTGF，CYR61和IGFBP3）高表达，患者存活率降低（图7F）。这表明，YAP在基底样（三阴性）乳腺癌中的表达水平，可用于预测一定肿瘤亚型患者的存活率。

图7 YAP在人基底样乳腺肿瘤中处于激活状态，并以肿瘤亚型依赖性方式预测患者预后

A.来自Mertins等人的蛋白质组学数据热图。对提供的CPTAC数据集进行筛选，以筛选出通过QC标准的样品。给基底样乳腺肿瘤与所有其他亚型肿瘤组合的样本分析应用了两样本Moderated t-检验。图中显示了从Zanconato等人研究中选择的重要蛋白质，Benjamini-Hochberg校正的p值进行调整后p值小于0.05。热图中，所有蛋白质以及所有样本的行标度采用中位数MAD归一化方式输入数据。按Edclidian distance的层次聚类应用于行，而缺失值则用灰色表示。* adj.p-值<0.05，**adj.p值<0.01，*** adj.p值<0.001，**** adj.p值<0.0001。B.管腔样（黄色）和基底样（蓝色）细胞系中的YAP靶基因的RT-qPCR分析。C.在基底样PDX模型中YAP（绿色）的共聚焦免疫荧光图像，比例尺20μm。右侧为核内YAP百分比定量。D. Kaplan-Meier图显示YAP表达高（红色）和低（黑色）的ER阳性和PR阳性患者的无病生存期（DFS）。E. Kaplan-Meier图显示具有高（红色）和低（黑色）YAP表达的三阴性乳腺癌患者的无病生存期。F. Kaplan-Meier图显示了YAP目标基因高（红色）和低（黑色）表达的三阴性乳腺癌患者的DFS。

讨论

在本篇文章中，研究者确定了证明基底样乳腺癌中Met、YAP和β-catenin作用的关键机制。Met信号传导调控YAP和β-catenin的核转运和激活，YAP和β-catenin相互作用并结合到Wnt靶基因增强子区域，进而激活靶基因转录。在YAP缺失的情况下，Met信号通路无法介导β-catenin的核易位，并将其隔离在细胞质中，防止Wnt靶基因的转录。因此，在基底样乳腺癌中，YAP是Met和β-catenin致癌机制中所必需的关键因子。

YAP的活性已被证明受多种上游机制的调控。利用遗传小鼠模型、蛋白质组学和磷酸化蛋白组学方法作为手段，研究者发现Met信号传导可促进YAP活性。研究者确定了两个可能有助于YAP激活的磷酸化位点，此外，他们的分析结果表明，Met信号传导对基底样特征的调节依赖于YAP，这表明，YAP在其他基底样乳腺癌模型的去分化过程中也可能发挥着重要作用。Met信号传导通过激活YAP调节癌症发生和转移。研究绕过Met受体仅通过过度表达YAP和β-catenin是否会导致与Wnt-Met相同的肿瘤，这将是非常有趣的。

Wnt-Met信号通路激活导致产生癌增殖细胞。已知Wnt /β-catenin活性在CSC中得到增强，并介导乳腺癌复发和进展，而多项研究表明Wnt /β-catenin与Hippo / YAP活性有关。Sulaiman等研究指出，Wnt和YAP活性双重抑制才能抑制基底乳腺癌细胞系中的CSC。在本研究中，研究者发现Wnt-Met肿瘤中的YAP和β-catenin靶基因均有所增加；此外，研究者在这些肿瘤的CSC中发现了激活状态的YAP。在功能上，YAP调控CSC特性：通过YAP的药理学抑制和基因敲除实验，研究者证明了YAP的缺失延迟了Wnt-Met介导的肿瘤发生，并降低了CD24^hi CD49f^hi癌症干细胞的扩增。此外，研究者证明了Wnt /β-catenin靶基因在YAP受到抑制后表达水平降低，表明在Wnt / Met肿瘤中，Wnt /β-catenin介导的CSC扩增依赖于YAP。

Wnt和Hippo信号通路具有紧密的联系，例如，在小鼠肝脏中，β-catenin和YAP的共激活可导致肝细胞癌的快速发生。研究表明，Wnt信号的缺失会导致由APC、Axin和GSK3组成的β-catenin破坏复合物将YAP / TAZ隔离在细胞质中。在这种情况下，胚胎干细胞中YAP / TAZ的敲除，导致β-catenin的活化并补偿Wnt信号的缺失。研究者发现，YAP的遗传敲除作用在两个方面上调控β-catenin的活性：1）在细胞核中，通过共结合β-catenin靶基因（例如Axin2）的调节区域；2）通过调节β-catenin的核转运来调节β-catenin的活性。基底样乳腺癌需要YAP调控核内β-catenin的活性。YAP对Wnt靶基因表达的主要调控可能与环境和组织有关,但是，YAP/β-catenin物理相互作用如何调节β-catenin活性的机制需要通过进一步的实验进行解释。

最近有研究发现，YAP在导管原位癌（DCIS）中无活性或者活性下调；此外，表现出高YAP活性的乳腺癌患者具有更好的总体阳性预后，因而YAP可能作为乳腺癌的抑癌剂。在这种情况下，严格控制YAP活性有助于肿瘤细胞逃避免疫监视，然而，其他致癌转录系统可能会刺激宿主产生强烈的免疫反应。这在一定程度上解释了Britchgi等人的研究发现：他们发现LATS1/2缺失导致的ER和YAP活性的上调降低了抗ER治疗的功效。这些研究没有表明YAP在其中（例如乳腺癌或肿瘤细胞亚型）的功能作用。

研究者的研究通过使用遗传性、siRNA敲降以及对YAP的药理学干预等方法，来解决基底样乳腺癌中的这些问题，以证明YAP在CSC中的功能。在基底样乳腺癌中，YAP的基因敲除大大延迟了Wnt-Met介导的肿瘤发生。对于管腔（ER+，PR +）乳腺癌患者和基底样三阴性患者而言，YAP表达水平与患者生存率的关系相反。高YAP活性与管腔型乳腺癌患者的生存期延长有关，但与基底样（三阴性）乳腺癌患者的生存期降低有关。因此，YAP似乎在某些癌症亚型中扮演着癌基因的角色，而在另一些癌症亚型中发挥着肿瘤抑制基因的作用。了解负责YAP相关功能的作用机制，以及其在基底样和管腔型乳腺癌中是否具有相反的效果，需要进行进一步的研究。

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https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33574090/