科研 | Cancer Res.: 单细胞蛋白质组学分析: 联合抑制AXL和JAK1是肺癌的一种新的治疗策略
编译：阿温，编辑：Tracy、江舜尧。
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飞行时间(CyTOF)流式细胞术同时在单细胞水平测量多种细胞蛋白，并用于评估肿瘤间和肿瘤内的异质性，这种方法可用于研究单个肿瘤对治疗反应的可变性。在本篇文章中，我们基于AXL信号对肺肿瘤亚群进行分层，以此作为一种潜在的靶向策略，而整合转录组分析用于研究AXL激酶抑制剂TP-0903如何影响转移性肺癌细胞中冗余的致癌通路。CyTOF谱分析显示，抑制AXL可抑制SMAD4/TGF-β通路，并诱导JAK1-STAT3信号通路，弥补AXL缺失，而在治疗初期肿瘤中，JAK1-STAT3的升高与AXL水平的升高有关。在晚期患者中，肿瘤中表现高AXL、高TGF-β和高JAK1信号的同时表现为CD133介导的肿瘤干性特性和混合性EMT特征，暗示其有往远处扩散的潜力。扩散拟时间分析揭示了四个不同类别的细胞命运轨迹，这些轨迹与每个患者的临床病理特征有关，从高AXL和JAK1肿瘤中获得的患者源性器官(PDOs)对TP-0903和ruxolitinib (JAK抑制剂)治疗敏感，也支持了CyTOF的发现。本研究显示，初发肺肿瘤相关治疗的单细胞蛋白组学分析，结合PDOs的体外实验，我们确定了在可能联合抑制AXL-JAK1的特定肿瘤中持续的AXL、TGF-β和JAK1-STAT3信号激活。
论文ID
实验设计
1. TP-0903治疗或shAXL敲低处理的A549细胞进行RNA-seq；
2. 分析了CyTOF数据，以确定细胞系中常见的细胞群落；
3. 探索肺肿瘤的异质性AXL相关致癌信号活动；
4. AXL过表达的细胞亚群中增加癌症干性和杂交EMT；
5. 肺肿瘤伪时间分析及类器官检查。
实验结果
1. 抗AXL治疗后JAK1-STAT3的代偿性激活
原发性肺肿瘤中AXL过表达可以单一阴性预测生存结果，并代表一个潜在的药物靶点(补充图S1A-C)，因此，我们首先测试了抑制AXL对两种转移性肺癌细胞株A549和H2009生长的影响(补充图S1D)。在两种细胞系中，随着TP-0903 (AXL抑制剂)浓度增加，增殖下降，并且在A549细胞中，随着shAXL敲低，增殖率下降(补充图S1E和S1F)，生长抑制在A549来源的小鼠异种移植模型中得到证实(补充图S1G)。为了确定抑制AXL对基因表达的影响，我们在TP-0903 (40 nmol/L)或shAXL敲低处理的A549细胞和对照细胞中进行RNA-seq(补充图S2A和S2B)，对差异表达基因的通路富集分析显示，抑制AXL可使TGF-β信号轴衰减，而JAK1-STAT3信号轴上调，可能是由于旁路机制所致(补充图S2C-E)。在TP-0903处理的细胞中，我们也观察到了肿瘤干细胞特性和EMT程序的转录组改变(补充图2F和2G)，毛细管WES蛋白分析证实了AXL对TGF-β信号传导的下游影响，但TP-0903对AXL相关通路癌蛋白的抑制作用较小(补充图S3和S4)。
2. AXL和JAK1在转移癌细胞中的有效靶向作用
为了进一步探测不同肿瘤群体中的AXL和JAK1-STAT3信号，我们分析了CyTOF数据，以确定未处理和处理TP-0903 (n=4)以及未处理肺肿瘤(n=11)的两种细胞系中常见的细胞群落。我们共筛选出21种CyTOF抗体进行亚群分析：1) AXL、JAK1-STAT3、TGF- TGF- TGF的致癌信号成分；2) 肿瘤干性标志物；3) EMT (图1A)，其中，免疫、基质和内皮细胞的标记最初被用于分离肺肿瘤和PBMCs中的非上皮成分。基于CK8/18和EpCAM的表达，人工门控白细胞共同抗原(CD45)聚集于阴性上皮细胞亚群(图1B)。其次，基于共同的蛋白表达，tSNE被用于对单个细胞进行聚类，以识别所有样本中常见的元聚类，共有92,798个CD45−/CK8+/18+/EPCAM+单细胞被分为27个亚群(图1C)，在所有样本的亚群中我们观察到不同的致癌信号、干性和EMT表达谱(图1D-G)，患者间也存在广泛的差异(图1 H-L；补充图S5-S14)。
一般来说，基于上述标记的CyTOF谱分析，细胞系亚群比肺肿瘤表现出更少的变异性(图2A)。在未处理的A549细胞中，有一个AXL高表达的优势亚群(#9)。TP-0903以40 nmol/L处理后，A549细胞中出现了3个新的亚群，其中#6和# 7显示出高水平的AXL，#8显示出减弱的AXL(图2B，左)。在这些亚群中我们观察到高JAK1-STAT3信号活性，这支持了原始RNA-seq研究结果，即JAK1-STAT3可能作为旁路机制导致耐药(补充图S2E)。磷酸化的STAT3 (pSTAT3)水平在a549处理的细胞中显著增加，而JAK1即使在TP-0903存在的情况下也稳定地保持高活性(图2B)，与毛细管WES蛋白分析结果一致(补充图S3和S4)，该处理抑制了A549细胞的三个主要亚群中的SMAD4(# 6-8)(图2B)，而SMAD2的上调可能是通过pSTAT3的增加而促进的(图2B)。根据CyTOF数据，第二株细胞系H2009对AXL抑制反应较弱，证实了之前我们通过毛细管WES观察到的结果(补充图S3和S4)。在该细胞系中，显示高AXL水平的亚群#12a和12b在TP-0903处理前被观察到，治疗后出现了两个主要的肿瘤亚群(#15和16)，并扩增了JAK1-pSTAT3的表达，暗示了高AXL水平细胞的耐药表型，与JAK1信号通路相比，AXL和SMAD4表达较低，说明药物影响了这些信号通路(图2C)。综上所述，转移细胞系的CyTOF分析发现JAK1-STAT3的信号成分可能是由AXL抑制外在引起的，也可能是内在存在的细胞存活和侵袭的旁路机制。
上述体外研究表明，单靶点药物治疗在抑制肺癌进展方面并不有效。为了验证JAK1可能是AXL抑制的旁路机制，我们在A549和H2009细胞中进行了TP-0903和/或ruxolitinib (JAK抑制剂)的短期(72小时)试验(图2D)。与H2009系相比，A549细胞对TP-0903处理的20、30和40 nmol/L的敏感性更高，然而，在治疗中加入ruxolitinib(15和20 mol/L)后，两种细胞系的细胞杀伤作用更加明显(P < 0.001)。为了证实CyTOF和药物联合作用的发现，我们用western blots证实了tp -0903处理的A549细胞中致癌信号标志物(JAK, STAT3, pSTAT3和pAKT)上调，肿瘤干性标志物(CD133和ALDH1A1)升高，以及上皮细胞标记物(EpCAM和CK8/18)和间充质细胞标记物(Vimentin和N-cadherin) 上调 (补充图S15)，处理后的H2009细胞中pSTAT3和pAKT水平进一步降低。与单药TP-0903相比，TP-0903 (20nmol/L)和ruxolitinib (15 mol/L)对两种细胞系的JAK1、pSTAT3、pAKT、CD133、Vimentin和EpCAM均显著减弱(补充图S15)。这一结果暗示联合治疗可能有效抑制AXL和JAK1-STAT3激活的肺癌细胞，并支持了CyTOF和RNA-seq的发现。
图2 采用流式细胞术(CyTOF)对TP-0903处理的肺癌细胞进行单细胞图谱分析
A 采用和不采用40 nmol/L TP-0903处理A549和H2009细胞亚群的t分布随机邻居嵌入(t-SNE)散点图。B-C t-SNE散点图显示了经TP-0903处理和未处理的肺癌细胞中致癌信号成分的表达水平。D TP-0903和/或ruxolitinib处理A549和H2009细胞72小时时细胞存活率的条形图。
3. 过表达AXL的细胞亚群中JAK1-STAT3和TGF-β表达增高
为了探讨肺肿瘤中AXL相关致癌信号活动的瘤内和患者间异质性，我们根据1）AXL表达水平，2）JAK（JAK1和pSTAT3）和TGF-β（SMAD2、SMAD4和TGFBRII）信号成分，3）亚群体规模，将上述27个亚群分为四类（I、II、III和IV）(图3A和B)。小提琴图分析进一步支持了这个亚种群分类：I) AXL、JAK1和TGF-β信号组分低表达；II) AXL中表达，JAK1、TGF-β信号组分高表达；III) AXL、TGF-β高表达，JAK1信号成分中表达；IV)包括AXL在内的5种信号组分均高表达(图3C)，总的来说，细胞系的异质性比肺肿瘤的要小。在IV类细胞系中，大多数(57-98%)的亚群表现出同时上调的AXL、JAK1和TGF-β细胞信号(图3A、3B和3D)，作为冗余机制，这些信号成分已经存在于某些亚群中，或可通过体外抑制AXL而被诱导。其余亚群被分配到具有中间信号活性的I-III类。
与细胞系相比，肺肿瘤亚群更多样化，涵盖所有四类(图3A和3B)，例如，患者(Pt) 008和010的肿瘤亚群属于I和II类(图3C和3D)。Pt 004、014和017具有优势的II类亚群(图3C和3D)，Pt 006有67%的肿瘤细胞属于III类(图3C和3D)，Pt 002、007、009、012和016的亚群被优先分配到IV类(图3C和3D)。这种跨越所有四种类型患者间的变异强调了基于肿瘤的主要表型定制治疗的必要性，II和IV类亚群细胞不同程度地存在于每个患者体内，表明了初治肺肿瘤中事先存在和冗余的信号通路(图3D)，此外，464个来自Pt 006的PBMC的循环肿瘤细胞(CTCs)属于第IV类，证实了这些细胞更有可能通过血液循环传播到患者的重要器官(补充图S16)。
图3 肺癌细胞系和肺肿瘤的不同亚群中按AXL表达水平排序的四种类型
A 根据增加的AXL水平排列亚群(小提琴图)。依次排列各亚群JAK1、pSTAT3、SMAD2、SAMD4、TGFBR2的表达热图。B 显示每个亚群在细胞系和肺肿瘤的大小。C 用小提琴图来说明在细胞系和肺肿瘤中的六种信号转导成分。D四类患者和细胞系的百分比。
4. 在AXL过表达的细胞亚群中增加癌症干性和杂交EMT
AXL和JAK1信号在癌症干性调控中得到了确认，因此，我们在CyTOF分析中纳入了肿瘤干性标志物OCT3/4、NANOG、CD133、CD44和ALDH1A1。一般来说，肿瘤干性标志物在III/IV类细胞系亚群和肺肿瘤中表达最高(图4A和4B)，此外，TP-0903治疗优先引起CD133升高的亚群，CD133是转移和治疗耐药的自我更新调节因子(图4C)。在肺癌的IV类亚群和侵袭性分期中，我们经常观察到CD133相对于其他标记物的较高水平，表明它们对TP-0903和其他治疗方法具有先天抵抗力(图4B和4D)。一般来说，晚期患者的肿瘤干性标志物表达水平较高，只有2例混合组织学的Pt 007和Pt 016早期肺肿瘤表现出高干性标志物，提示其具有更强侵袭性的表型(补充表S1和图4D)。
图4 肿瘤细胞系和肺肿瘤的肿瘤干性特征
A 每个亚群的OCT3/4、NANOG、CD133、CD44和ALDH1A1的表达热图在单个亚群中与上升的AXL水平对齐。B 小提琴图用于突出四类细胞系和肺肿瘤的五种肿瘤干性标志物。C 比较40 nmol/L TP-0903处理前后5个肿瘤干性标志物在细胞系中的表达情况。D 5个肿瘤干性标志物在早期和晚期患者中的表达情况如图小提琴图所示。
CD133表达升高是EMT的典型标记，因此，我们对27个细胞亚群的10个EMT标记物(SNAIL, TWIST,Vimentin, N-cadherin, Fibronectin, β-catenin, ZO2, PECAM, EPCAM和CK8/18)进行了CyTOF分析，间充质标记物与高AXL水平相对应，而上皮标记物在II和IV类中更占优势(图5A)。根据上皮细胞(E)和间充质(M)指数，IV类亚群表现出最高的EMT杂交状态(图5B)；此外，TP-0903处理在这些亚群中产生了更高的E和M指数，使间充质/上皮对转移具有更大的可塑性(图5C)。为了证实这种混合状态，我们使用AFM来探测TP-0903处理和未处理细胞的生物物理特性——刚度、变形和粘附性(图5D-F)，其中，刚度以压力单位表示为杨氏模量，而变形则以长度单位表示，我们还通过预先设定的力来评估某一选定点的细胞压痕深度，其中，粘附力是以力(牛顿)为单位来衡量的，并量化一个细胞粘附在另一个细胞或基底膜上的能力。总的来说，相对于未处理的细胞，TP-0903处理的细胞变得更像上皮细胞，硬度和黏附增加，畸形减弱(图5F)，对于TP-0903处理，A549细胞的刚度增加了3倍，变形减少了25%，粘附增加了50%；H2009细胞的响应适中，硬度仅增加61%，粘附力增加35%(图5F)。一般情况下，早期肿瘤E、M指数较低，晚期肿瘤E、M指数较高(图5G、5H)，而早期患者的肿瘤Pt 007和Pt 016表现出较高的E和M指数值，表明其具有更强侵袭性的表型(图5G和5H)。我们的发现暗示，获得一个混合的EMT表型可以使侵袭性细胞同时保留上皮和间充质的特性，用于远处转移。
图5 肺癌细胞系和肺肿瘤的上皮-间充质转变(EMT)的概况
A 将每个亚群间充质(M)和上皮(E)标记的表达热图按相应增加AXL水平的顺序进行排列。B-C用散点图比较了分别处理和未处理TP-0903的A549和H2009细胞各亚群的E和M指标值。D 一个明亮的视野图像的H2009细胞探测原子力显微镜(AFM)显示。E 给出了原子力显微镜图像形成的示意图。F 比较了在40 nmol/L TP-0903处理和不处理A549和H2009细胞的生物物理特性(即硬度、变形和粘附)。
5. 肺肿瘤不同的前行和退行模式
我们用伪时间分析来模拟这四类细胞的过渡状态，11例肺肿瘤的发展轨迹会令人联想到线性或间断的进化模型(图6和补充表S1)，6名患者的肺肿瘤呈常规轨迹，从I类无缝过渡到IV类，例如Pt 008的肿瘤标本为早期IB浸润性腺癌，具有乳头状特征，细胞由I类转移到II类，表现出侵袭性最小的表型(图6A)。另一方面，Pt 010从I类过渡到IV类，表明其具有更强的侵袭性表型，而且该患者为IA期中分化腺癌，在组织病理学检查中伴有微乳头状和腺泡的特征，这些特征通常与间质浸润有关，与无这些特征的侵袭性腺癌相比，预后较差(图6A)。同样，Pt 014有早期IA侵袭性腺癌(腺泡为主)，细胞命运从II类突然过渡到IV类(忽略I类)(图6A)，Pt 002(转移性气管旁淋巴结)和Pt 009(中分化癌，混合利皮蒂型、实体型和腺型的组织)均具有侵袭性IIIA期腺癌，也具有最高的转移潜力，而肿瘤细胞的归宿为II类和IV类亚群(图6A)，这些患者的肿瘤亚群可能来自一个共同的起源，并逐渐分化为更先进的类别。
Pt 004和016显示肿瘤细胞转变为高危IV类，但与其他阶段不同的是，中间阶段从III→II，然后跳跃至IV(图6A)，这种两分法可以部分解释为它们在不同的组织病理学被发现。Pt 004为中分化的IIIB期腺鳞癌；这两个同步的肿瘤成分可能解释了从低转移潜能到高转移潜能的突然转变,更令人吃惊的是，这个病人在右上肺叶有一个单独的浸润性癌肿瘤结节，这意味着他比这一类型的其他病人有更高的转移潜力。但是，Pt 016为早期IB浸润性腺癌，以乳头状为主生长和局灶性间质浸润，这种侵袭性较弱的组织学形态可能可以解释其从II类到IV类到III/II中期阶段突变的不稳定性。
其余肺肿瘤的伪时间分析缺乏中期阶段和细胞命运在短爆发非线性发展。Pt 007为IB期腺癌，组织学以腺泡为主，可以解释间断型肿瘤模型(图6B)，腺泡腺癌预后中等，不良的表现为间质浸润(成束断裂的弹性纤维)，间质增生，腺体不对称。Pt 012为早期IA型肺腺癌，腺泡为主，微乳头状特征，可解释分支瘤形态(高危III ~ IV级和II ~ IV级进展)(图6B)，与腺泡为主的肿瘤相比，微乳头状腺癌的生存率最低，这种类型的肿瘤通常与晚期淋巴结分期有关，Pt 012接受了有限的楔形切除术后，我们无法评估肿瘤对淋巴结的影响。
肿瘤亚群从高风险类别过渡到低风险类别的间断回归模型仅适用于Pt 006、009和017 (图6C)。Pt 006表现为IIB期低分化腺癌，亚群被划分为高风险III/IV类(图6C)， CTCs属于IV类(补充图S16)。值得注意的是，对Pt 006肿瘤标本的假时间分析暴露出不同的克隆系：1)肿瘤由III类向IV类进展；2)肿瘤由III类回归到II类；3)停滞(III类)(图6C)。Pt 009为晚期IIIB期中分化侵袭性腺癌，肿瘤直径2.1 cm，混合组织学(利皮细胞型、实体型和腺体型)，其侵犯胸膜和淋巴血管，累及淋巴结(13例中有3例)。鳞状腺癌以鳞状生长为主，预后良好，而实性腺癌以肿瘤坏死、淋巴血管间隙和内脏胸膜侵犯为主要表现，且预后差。肿瘤标本009显示出肿瘤进展(III级→II级→IV和III级→IV)和肿瘤退行(III级→II)的多克隆谱系，而这可以通过疾病晚期和混合组织学解释(图6C)。Pt 017表现为侵袭性腺癌IV期(良好分化至中度分化)，而相关患者的肿瘤标本来源于胸膜转移，其伪时间分析为自发回归的间断模型，肿瘤细胞亚群向低风险类(II类→I)和高风险类(II类→IV)过渡(图6C)，为了适应这种间断模型，所有这些肿瘤的细胞亚群可能在早期被预先编程成为转移或耐治疗。
6. 优化了AXL和JAK1在患者源性类器官中的靶向作用
PDOs是从肿瘤标本中建立的三维培养物，用于药物检测的肿瘤及相关细胞 (图6D-F)，PDOs的短期治疗是为了检测AXL和/或JAK抑制剂对I - IV类肿瘤细胞亚群的总体效果。我们假设，表达中到高水平AXL和JAK1相关蛋白(III类和IV类)的肿瘤对这些治疗最有反应，而属于I类(AXL和JAK1-STAT3表达最低)的肿瘤可能没有反应。基于上述体外试验(见图2D)，我们选择TP-0903 (20nmol/L)和ruxolitinib (15 mol/L)进行PDO试验。在短期药物治疗设计中(图6G)，具有I/II类肿瘤细胞亚群的Pt 008和010的PDOs对TP-0903 (20 nmol/L)或ruxolitinib (15 mol/L)均无明显反应(图6G；补充图S8、S10)，而Pt 016的PDO有59%的肿瘤亚群属于IV类(AXL和JAK1-STAT3信号成分的高表达)，且对15 mol/Lruxolitinib单独反应良好，但与20 nmol/L TP-0903联合治疗后72小时协同作用不明显(图6G；补充图S13)。Pt 014和017的PDOs属于II类(中等水平的AXL和JAK1-STAT3表达)，单独使用TP-0903或ruxolitinib均可使细胞活力降低10-20%(图6G；补充图S12、S14)，这些初步结果表明，肺肿瘤的细胞学谱分析可以为抗AXL和JAK1药物在相应类器官的优化检测提供预测信息，这将会使肺癌患者治疗更加个性化。
图6 肺肿瘤伪时间分析及类器官检查
A线性模型的扩散映射。B标点模型的扩散图。C间断回归模型的扩散图。D病人源性器官样体(PDOs)短期药物治疗过程流程图。E有机物形态的亮视图像。F PDOs中DAPI(蓝色)、CD45(红色)、泛细胞角蛋白(绿色)和EpCAM(紫色)的免疫荧光图像。G 20 nmol/L TP-0903和/或15 mol/Lruxolitinib处理PDOs后72小时细胞存活率条形图。
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